|
研究人员对279名头颈鳞癌患者进行了分析，描绘出较为全面的头颈鳞癌的综合表征，该研究为开发头颈鳞癌新的治疗方法以及药物靶点提供了依据。 文章题目：Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas 研究人员：癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas Network,TCGA) 发表时间：2015.01.29 期刊名称：Nature 影响因子：40.137研究背景 全球每年约有60万人患头颈鳞状细胞癌 (head andneck squamous cell carcinomas，HNSCCs)。HNSCCs的特点是在表型组学、病因学、生物学和临床上均表现出异质性。吸烟是导致发展中国家HNSCC发病人数增长的重要原因之一，而人乳头瘤状病毒(HPV)则是导致发达国家中不吸烟者患口咽部肿瘤的重要因素。尽管可以通过手术、放疗和化疗进行治疗，但仍会导致大约一半的患者死亡。HNSCC的风险程度是根据肿瘤的解剖部位，分期和组织学特征进行分级。除了HPV之外，许多已经被研究的分子和临床风险因素也具有一定的临床效果。 研究方法 样本选择： 样本共279例，其中口腔癌172例，口咽癌33例，喉癌72例，喉咽癌2例，大多数患者为男性（n= 203，73％）和重度吸烟者(平均烟龄51年）。36例为HPV（+），243例为HPV（-）。 研究成果 DNA和RNA结构变化 大部分肿瘤样本中都存在拷贝数变化（copy numberalterations，CNAs），比如染色体3p、8p区域部分缺失，3q、5p和8q区域部分扩增（图1a），在肺鳞状细胞癌（LUSCs）中也有类似情况存在（图1a）。通过分析微阵列数据，发现HNSCC基因组CNAs（扩增或缺失）平均值达到141，表现出较高的不稳定性。通过“高覆盖度”的全基因组分析确定了平均每个肿瘤有62个结构畸变（染色体融合）（n = 29）。研究人员发现存在39个复发性(recurrent)拷贝数缺失区域和23个复发性拷贝数扩增区域（q <0.1）。hpv（+）和（-）的肿瘤都存在3q26 28区域复发性局部扩增，3q26=""> HPV（+）肿瘤的特征是存在TNF(肿瘤坏死因子)受体相关因子3（TRAF3）的截短突变(truncating mutations)（n =3，8％）和新型复发性缺失（n =5，14％）。TRAF3与天然免疫相关，此外还与获得性抗病毒应答相关，相关病毒包括Epstein–Barr，HPV和HIV。TRAF3缺失(变异)能促使NF-κB信号通路的异常激活。据研究人员所知，虽然之前在血液恶性肿瘤和鼻咽癌的相关文章中曾涉及到TRAF3蛋白失活，但这是首次将TRAF3蛋白与HPV相关癌症联系到一起。HPV（+）肿瘤在E2F1基因区域存在显著局部扩增，并且大部分HPV（-）肿瘤在包含 CDKN2A基因的9p21.3区域存在缺失。 HPV（-）肿瘤的特征是存在11q13和11q22区域的共扩增(co-amplifications)，共扩增区域内存在与细胞死亡相关的/NF-kB和Hippo信号通路基因。此外，部分HPV(-)肿瘤在核SET域基因(nuclear set domain gene)以及肿瘤抑制基因内存在新的局部缺失。大部分HPV（-）肿瘤中受体酪氨酸激酶都存在复发性局部扩增。通过CNAs的无监督聚类分析，发现了一个互相排斥的子类，这个子类中大部分样本都是CNAs数量减少的口腔癌样本，在癌症中也被叫做‘M’类(该类肿瘤由突变驱动，而不是CNA)(图1b)。这个子类中的样本具有一种新三基因模式(new three-gene pattern)，在此模式下，HRAS内突变被激活，CASP8突变和野生型TP53失活。野生型TP53、突变HRAS和CASP8，这三个基因的组合(constellation)表明了存在另一种涉及RAS和/或细胞死亡/NF-kB信号通路变化的肿瘤发生通路 图1 DNA拷贝数变化 为了检测是否存在新的结构改变，研究人员对全基因组和RNA-Seq数据进行分析。实体瘤内已经发表的融合致癌基因，例如涉及ALK，ROS或RET的基因，在HNSCC样本中均未观察到。先前发表的FGFR3-TACC3融合发生于两例HPV（+）肿瘤中。在279例患者中，只有1例是先前在相关文章中发表过的EGFR（vIII）亚型—— III型。虽然研究人员没有发现新的致癌基因融合，但通过几个样本发现EGFR或FGFR3的1号外显子与非复发性伴侣（non-recurrentpartners）发生融合，表明伴侣基因存在潜在启动子互换。在两个HPV（ - ）肿瘤中发现了低概率的选择性MET转录物(alternative MET transcription)，其中14号外显子被跳过，这一发现在非小细胞肺癌领域意义重大。结构改变（纯合子缺失，染色体内和染色体间融合）通常与肿瘤抑制基因中的功能丧失相关，其中最显著的是CDKN2A，其次是TP53，RB1，NOTCH1和FAT1。编码蛋白融合(protein-codingfusion events)反而与抑制基因的功能丧失之间联系不大。RNA测序数据分析表明HNSCC中某些基因存在选择性剪切，比如基因KLK12和TP63。 通过DNA分析，发现大多数HPV（+）肿瘤存在宿主基因组整合，通常发生在肿瘤的单个基因组位置，并且几乎总是与宿主基因组的扩增相关联。通过分析RNA转录本，证实存在跨病毒-人基因座转录。然而，没有检测到相关基因，这表明HPV整合不是由单一驱动机制驱动。类似地，在HPV（+）细胞系中的MYC基因中也没有检测到整合位点。 2.体细胞突变 全外显子测序分析鉴定出发生体细胞突变的基因，许多突变基因都位于CNAs区域并且在COSMIC数据库中被标注出来（图2）。目标基因的平均测序覆盖度为95×，82％的目标基因覆盖度在30×以上。在279个样品中，检测到来自单核苷酸多态性数据库（dbSNP）的 12,159个同义体细胞突变体，37,061个非同义体细胞突变体和2,579个种系单碱基替换。394个特定区域的靶向重新测序确定了99％发生了突变。分析突变等位基因表达产物RNA确定了86％病例中存在变异。HPV（-）肿瘤中大多存在CpG位点的翻转，而HPV（+）肿瘤中TpC突变较为频繁，突变率并没有因HPV状态(阴性或阳性)不同而有所不同，这一点与之前发表文章所述相反。根据统计学分析，突变基本在11个基因上富集（图2）。导致失活性突变（通过无义，移码或剪接位点突变提前终止蛋白质翻译）的4个基因基本都出现在HPV（-）肿瘤中。有2个基因与细胞周期和生存相关（CDKN2A（P<><0.01）），有2个基因与wnt><0.01），ajuba（p=0.14））。研究人员发现86％的hpv（-）样本中都会发生tp53突变，而36例hpv（+）中只有1例具有非同义tp53突变。体细胞突变和ajuba缺失主要是由于功能性lim域5'端发生失活突变和错义突变聚类，ajuba是一种调节细胞分裂，脊椎动物纤毛形成和左右轴确定（left–rightaxis determination）的中心体蛋白。此外，atm(ataxia telangiectasia-mutated，毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白)和atr(atm="" 和rad-3相关蛋白)激酶能够调节dna损伤应答反应,在肿瘤的入侵和迁移的前提下，ajuba具有依赖egfr-ras-mapk的磷酸化作用的倾向，且与hippo生长和再生通路（hippo="" growth="" and=""> 图2 HNSCC中的显著突变基因 33例HNSCCs中存在NSD1(核受体结合SET 域蛋白1)频繁突变，突变包括失活突变(n=29)和局部纯合子缺失(n=4)。NSD1是类似于SETD2的组蛋白赖氨酸(H3K36)甲基转移酶。NSD1失活突变的种系携带者存在患颅面畸形和恶性肿瘤的风险，这表明NSD1是一个肿瘤抑制基因。有趣的是，在融合白血病中的NUP98基因时，NSD1又起到致癌基因的作用。涉及其他专一性H3K36甲基转移酶基因(WHSC1)的易位发生在20%的多发性骨髓瘤病例中。NSD1的缺失与散发性非黑色素瘤皮肤癌有关。显著突变基因(NOTCH1,19%)常与鳞状分化相关的变异有关,其余非显著突变家族成员(NOTCH2,9%和NOTCH3,5%)，TP63和ZNF750在17q25.3的位置有显著的缺失峰。研究分析确定了一些新的显著突变，例如在TRAF3，RB1和NFE2L2内。频繁突变的凋亡基因CASP8在第一个死亡效应子，内含子和半胱氨酸蛋白酶肽酶结构域中存在聚类错义突变和失活突变。KMT2D（也称为MLL2）和HLA-A在统计学意义上的显著突变可能导致免疫监视的缺陷。在已知的致癌基因的统计学分析中，只有PIK3CA突变达到统计学显著水平。PIK3CA突变中约有四分之一的病例存在并发扩增(concurrentamplification)，还有20％的肿瘤存在局部扩增但却没有突变的迹象。73％的PIK3CA基因突变位于Glu542Lys，Glu545Lys以及His1047Arg/Leu热点区域有促进激活的作用，其余的突变功能还不明确。 研究人员将显著突变基因和COSMIC上发表的基因的无监督全基因组分析扩展到亚组分析，通过解剖位点、肿瘤状态与正常状态、HPV状态等样本信息和四个先前验证的基因表达产物对亚组加以区分。新确定的突变包括TRAF3，RB1和NFE2L2，研究人员还确定了HRAS等基因的突变在统计学上达到显著水平。散发性失活突变和TGFBR2缺失主要存在于口腔癌中，与其在小鼠模型中具有促进鳞状肿瘤发生的作用相吻合。COSMIC数据库中突变基因的研究集中在包含FBXW7基因的4q31.3处的显著缺失峰（一种靶向cyclin E和NOTCH基因的泛素连接酶），在该缺失峰处研究人员发现了复发性Arg505 Gly / Leu替换（n=14）。至少具有一个与先前在COSMIC上发表的相同突变的基因包括SCN9A，CHEK2，PTCH1和PIK3R1。对于潜在药物作用靶点相关的体细胞突变和蛋白表达，研究人员会继续关注。 图3 候选治疗靶点和致癌基因驱动 3.整合基因组分析和通路分析 通过相关的基因组改变分析，发现了很多重要信息。 例如，包含CCND1，FADD和CTTN基因的11q13区域与可能包含YAP1和BIRC2的11q22区域发生共扩增。染色体11q22在与11q13发生共扩增的区域下很少扩增。 这个新的发现表明，这种共扩增的选择压力源于BIRC2与FADD的相互作用和抑制细胞死亡的胱天蛋白酶的级联反应。 值得注意的是，在11q13区域发生扩增的绝大多数肿瘤在11q22的端粒区域（包括在癌细胞死亡中有重要作用的基因如ATM和CASP1,4,5,12）会存在大量缺失。 基因表达产物亚型可分为类atypical(24％),mesenchymal(27％),basal(31％)和classical(18％)。值得注意的是，TP53突变，CDKN2A功能丧失，染色体3q扩增，氧化应激基因（KEAP1，NFE2L2或CUL3）改变，重度吸烟史和larynx sub-site常常同时出现在classical类肿瘤中。 总的来说，这些发现表明，NFE2L2氧化应激通路是跨肿瘤位点的与烟草相关的标记。 相比之下，basal类肿瘤具有完整的氧化应激通路信号，只有少量的3q染色体改变和NOTCH1失活。对3q区域的分析显示，相对于所有其他类中的HNSCC样品和癌细胞周边组织样品，basal类肿瘤中SOX2表达量较低。此外，basal类肿瘤大多具有HRAS-CASP8共突变或11q13 / q22共扩增的特征。综合以上发现和HRAS突变，可以确定破坏细胞死亡是basal类肿瘤的主要特性。Atypical类肿瘤的特征是缺乏7号染色体扩增，并且包括很多9号外显子区域激活突变的HPV(+)肿瘤。相比之下，mesenchymal类肿瘤表现出高水平的先天免疫基因的改变，特别是自然杀伤细胞markerCD56的高水平表达和HLA I类 的低频率突变。在显著突变的基因中，TP53，CASP8，NSD1和CDKN2A解剖部位来源差异最大。CASP8突变常出现在口腔癌中（n=22，92％），口咽癌中TP53，NSD1和CDKN2A位点的突变频率较其他位点低。 通过对不同HPV状态下肿瘤的反相蛋白阵列、DNA甲基化、miRNA平台的无监督聚类分析，发现一些聚类具有跨平台的高相关性（图4），并存在基因协调改变。在更复杂的跨平台分析中发现，分子亚型与单基因改变存在联系，例如，在atypical类和classical类中均检测到NSD1低甲基化以及功能丧失性突变，还检测到了野生型NOTCH1。 对miRNA，基因表达和DNA甲基化数据进行监督聚类分析，发现了与解剖部位相关的基因组特征以及HNSCC 中miRNA反向调节的靶基因 。在这些miRNA-信使RNA网络中，let-7c-5p和miR-100-5p的表达情况与低拷贝数相关。与正常细胞相比，肿瘤细胞中let-7c-5p和miR-100-5p的表达量较低。 这些miRNA的表达和遗传信息的缺失与靶基因（包括细胞周期调节剂CDK6，转录因子E2F1，有丝分裂调节剂PLK1和转录因子HMGA2）表达量增加高度相关。 图4 综合分析基因组变化 综合生物信息学分析，根据频繁变化的基因组区域确定了几条通路（图5）。受体酪氨酸激酶，EGFR/ERBB2,FGFR1/3的基因组改变较为频繁。在受体酪氨酸激酶（RTK）/ RAS /磷脂酰肌醇-3-OH激酶（PI(3)K）通路的下游靶点，PIK3CA偶尔会使基因HRAS和PTEN发生改变。在该通路更下游区域，几乎每个样本控制细胞周期的基因都发生了改变。在HPV(-)肿瘤中，肿瘤抑制基因TP53和CDKN2A，致癌基因CCND1和MYC以及miRNAlet-7c常常发生改变，在HPV（+）肿瘤中，则通常是病毒基因E6，E7和E2F1发生改变。另外，研究人员发现涉及细胞死亡，NFkB介导的信号存活反应和免疫信号通路的基因频繁改变。 FADD±BIRC2或CASP8±HRAS共扩增只发生在HPV（-）肿瘤中，而TRAF3缺失也只存在于HPV（+）肿瘤中。TRAF3和HLA的缺失与先天抗病毒免疫和适应性抗肿瘤免疫失调有关。还发现NOTCH，TP63和其他一些HPV（-）肿瘤中的基因与β-连环蛋白（CTNNB1）相关。此外，NFE2L2是氧化应激反应中一个关键的转录因子受体，可以围绕它展开进一步研究。 图5 信号通路和转录因子失调 结论 该文章进行了较为全面的HNSCC综合基因组分析。HPV（+）口咽癌中TRAF3缺失、PIK3CA突变激活、E2F1扩增表明存在NF-kB通路、其他致癌通路、细胞周期相关通路的异常激活。在HPV（-）HNSCCs中，互相排斥的子集(mutuallyexclusive subsets)包括含有CCND1,FADD,BIRC2,YAP1的11q扩增子，和CASP8,HRAS的并发突变，以及细胞周期、细胞死亡、NF-kB、其他致癌基因通路。最近研究表明，AJUBA,FAT1,NOTCH1的失活可能会导致Wnt / β-catenin信号通路失活，这与细胞极性和特异性失调有一定关系。HPV（+）和HPV（-）肿瘤中发现3q扩增子(包括转录因子TP63,SOX2和信号分子PIK3CA)与上皮干细胞稳态和细胞分化有关。BIRCs，PI(3)K，Wnt/β-catenin和Notch的生物学功能和靶向药物还在进一步研究中。以上发现为研究HNSCC提供了新的思路，可以针对一些突变进行更深入的研究，也许能对肿瘤的预防和治疗提供一些帮助。 参考文献： [1] The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive genomic characterization of headand neck squamous cell carcinomas[J]. Nature, 2015,517: 576–582. |
|
|
