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近日国家自然科学基金委员会官网公布了“血管稳态与重构的调控机制重大研究计划2018年度项目指南”。该项目拟重点资助如下研究方向： （一）集成项目 血管微环境稳态与血管重构的调控：着重探讨血管壁细胞的自平衡机制，解析血管不同细胞类型间及与细胞基质交互作用的新机制；明确血管重构过程中血管的代谢微环境；利用新技术新方法分析血管重构疾病中血管微环境的动态变化。 （二）培育项目 1、血管稳态维持的关键基因、信号通路及调控网络。 着重研究在血管功能调节中起关键作用的基因、蛋白质及其修饰，阐明其在血管稳态及疾病中的生理及病理学意义。鼓励在包括单细胞测序、亚细胞器蛋白组等高通量组学研究的基础上，建立血管功能、疾病相关生物过程的基因、蛋白数据库及计算生物学新方法。 2、血管损伤修复的新技术和新方法。 利用组织工程、再生医学、基因及药物治疗、分子影像学等方法，结合多学科交叉手段研究血管损伤修复的新技术和新方法。 为了响应党的号召~~于是小编梳理了近期心血管疾病蛋白质组学研究的案例，以飨读者。 Case Study One ：人类心脏组织蛋白质图谱的绘制 2017年德国马克斯-普朗克研究所的研究人员分析了3个健康心脏样本，16个不同解剖学区域和4类心脏细胞中的蛋白质组学，为后续不同心脏疾病的研究夯实了基础, 研究结果发表于著名学术期刊Nature Communications。 研究思路和成果 研究人员基于Lable free的方法，对健康心脏组织和细胞样本进行蛋白质组学分析，并通过“in-StageTip（iST）”法减少样本制备时间，耗损以及降低污染，而“loss-less”方法的引入使得肽段需求量降低至30μg。综合以上方法，研究人员在不同解剖区域的组织样本中鉴定到10751个蛋白，细胞样本中鉴定到10447个蛋白，数据整合后，鉴定到的蛋白超过11000，这也是迄今健康心脏样本蛋白质组学最大通量的研究（图1-1）。 图1-1 蛋白质组学workflow和组学初步结果。a、蛋白质组学workflow；b-d、蛋白质组学初步结果 将上述分组细化，并对其进行生物信息学分析，结果显示，不同解剖学区域的组织样本和细胞样本中，蛋白表达具有相当的组织特异性（图1-2）。 图1-2 心脏蛋白质表的组织特异性表达 对差异蛋白的功能进行进一步分析，可为后续研究提供大量理论依据与暗示。如心脏四腔中线粒体蛋白的含量（21%）远高于Hela细胞和瓣膜及血管，提示心房与心室部分的心肌细胞需要更多的有氧呼吸以维持其生理学功能（图1-3）。 图1-3 心脏四腔蛋白组中有大量线粒体蛋白质 既然已经获得正常人目前最全的心脏蛋白质组学数据库，那么能否用它作为reference library，通过比较和心脏病人的蛋白质组学进行比较，获得一些对疾病诊断、治疗有关的信息？ 研究人员将上述健康人群左心房部分的蛋白质组学数据与房颤患者进行比对分析，得到如下结果：相对于健康的左心房样本，患者组共定量到104个下调表达蛋白和307个上调表达蛋白。其中部分ECM蛋白（如DSTN, ITGB2, ITGAM, 和FLNB）表达高度上调，而另一部分（包括COL1A2, COL3A1, 和 ITGB1）表现出明显下调。而下调最为明显的当属部分线粒体蛋白，房颤患者的线粒体功能异常已然见诸报道，但其深层的患病机制仍需后续进一步研究（图1-4）。 图1-4 健康人群与房颤患者定量蛋白质组学比较。房颤患者中，线粒体蛋白普遍升高，包外基质蛋白含量下调
Case Study Two：心脏衰竭模型小鼠心脏乙酰化修饰蛋白组 2016华盛顿大学代谢中心的研究人员对心力衰竭模型小鼠的心脏进行了蛋白质组学与乙酰化蛋白质组学研究，解释了蛋白质乙酰化在心力衰竭病程中的关键作用，并为心力衰竭干预治疗提供了方向。研究结果发表在心血管顶级杂志Circulation上。 研究思路与结果 1、扩大NAD+池可以逆转心力衰竭引起的蛋白质高乙酰化和NADH/NAD+比值升高 作者发现在心力衰竭缺血性或扩张型心肌病患者的心脏组织中蛋白质乙酰化水平很高。此外，由横向主动脉缩窄(TAC)引起的压力超负荷使心脏NADH/NAD+比值和线粒体蛋白高乙酰化升高，进一步说明NAD+敏感的蛋白乙酰化与心力衰竭发展的正相关。（图2-1） 图2-1 恢复NADH/NAD+比值能使减轻衰竭心脏中的蛋白过乙酰化 作者通过补充NAD+的前体烟酰胺单核苷酸（NMN）或在小鼠心脏中过量表达限速酶尼古丁酰胺磷酸化水平转移酶（cNAMPT），经由NAD+补救途径提高NAD+合成。发现两种方法均能在不影响小鼠心脏功能的情况下提高NAD+水平。还发现NMN处理使NADH/NAD+比值正常化，同时逆转了TAC模型小鼠线粒体蛋白高乙酰化。（图2-1） 2、心脏蛋白质乙酰化影响慢性应激时心力衰竭的形成 作者发现NMN逆转蛋白高乙酰化能改善心脏功能，减少压力超负荷引起的病理肥厚。TAC在对照组小鼠中引起显著的心肌肥厚、左室扩张和左室短轴缩短率下降。而NMN能改善TAC应激小鼠的短轴缩短率、左室扩张和肥厚。此外，NMN还能抑制TAC后的cKO小鼠心脏衰竭的加速进程。（图2-2）作者还发现过表达cNAMPT也有类似改善效果。 图2-2 NMN逆转蛋白高乙酰化能改善心脏功能 3、心脏乙酰化组学分析响应NADH/NAD+比值变化乙酰化蛋白质 为了证实对NADH/NAD+比值敏感的蛋白乙酰化可以调节心脏对压力的敏感性这一假设，对cNAMPT和不含cNAMPT的cKO心脏进行了乙酰组学分析（图2-3）。为了排除cKO中总蛋白量增加对乙酰化蛋白增加的影响，作者比较分析线粒体蛋白质组，没有观察到线粒体蛋白水平的显著上调。 图2-3 心力衰竭心脏乙酰化蛋白质组学 乙酰化蛋白质组结果表明：①cNAMPT可降低cKO心脏乙酰化蛋白的数量和乙酰化肽的水平。②心力衰竭心脏中苹果酸天冬氨酸穿梭(MAS)蛋白的高度乙酰化，cNAMPT过表达使MAS的乙酰化水平回归正常。③乙酰化组分析鉴定的几个参与了mPTP调控的高乙酰化蛋白，mPTP的开放与心脏钙保留有关。 作者随后着重研究了MAS和mPTP相关蛋白质乙酰化对心力衰竭病程的影响机制。得出结论：NAD+氧化还原失衡引起的线粒体蛋白高乙酰化可通过两种不同的机制导致心脏的病理重构。在衰竭的心脏中，可以通过矫正NADH/NAD+失衡治疗心力衰竭，比如施加NAD+前体药物。 Case Study Three：Sirt5敲除小鼠心脏琥珀酰化蛋白质组学 2016年康奈尔大学的林和宁教授及其同事通过二甲基标记的定量蛋白质修饰组技术，比较分析了野生型和Sirt5敲除的小鼠心脏的琥珀酰化修饰组，发现了一个脂肪酸代谢相关蛋白ECHA的活性在Sirt5敲除鼠的心脏中降低。进一步的研究表明这种调节作用与肥大型心肌病有关。林教授表示：“这项工作表明了Sirt5和琥珀酰化在心脏代谢功能上的重要作用。” 研究思路与结果 1、修饰化泛抗体检测小鼠不同组织乙酰化与琥珀酰化修饰水平 作者通过Western blot检测了Sirt5 WT和KO小鼠的不同组织中蛋白琥珀酰化和乙酰化状态。Sirt5被敲除后，所有组织的琥珀酰化水平都增加了，其中心脏的琥珀酰化水平增加最显著；另外，Sirt5对小鼠各个组织的蛋白质乙酰化水平无影响。
图3-1 Sirt5WT与KO小鼠各组织琥珀酰化与乙酰化水平检测 2、Sirt5 WT与KO小鼠心脏琥珀酰化蛋白质组学 采用二甲基标记的定量蛋白质组学分析比较Sirt5 WT和KO心脏中琥珀酰化肽的丰度，发现124个琥珀酰化蛋白可能受SIRT5调控，其中ECHA的琥珀酰化赖氨酸位点最多，在ECHA的66个赖氨酸残基中，28个是琥珀酰化的，其中26个仅在Sirt5 KO心脏中发现，这表明ECHA是Sirt5的靶点。（图3-2）
图3-2 小鼠心脏琥珀酰化蛋白质组学workflow与结果分析 作者随后的实验都围绕Sirt5与ECHA开展，发现Sirt5通过去琥珀酰化激活ECHA；ECHA K135琥珀酰化对其活性影响最大；SIRT5的缺失导致ECHA琥珀酰化水平升高，进而使脂肪酸氧化减少和长链脂肪酸酰基辅酶的积累。 3、SIRT5 KO小鼠出现心脏功能减退和心肌肥厚 心脏中ATP消耗非常快，因此需要一个持续的ATP供给才能保持心脏正常工作。而Sirt5敲除影响了ECHA活性，造成了脂肪酸氧化减弱，可能会影响心脏的能量供给。为了进一步探究Sirt5WT和KO小鼠的心脏功能，作者对8周大的小鼠进行了夜间禁食后的超声心动图检查，发现Sirt5 KO小鼠的缩短分数和射血分数均降低，表明Sirt5缺失后心脏功能降低。同时，心肌横截面积测量结果显示Sirt5 KO小鼠的心脏肥大。（图3-3）
图3-3 Sirt 5敲除造成小鼠心脏功能减退和心肌肥厚 正如作者所说：这项工作表明了Sirt5和琥珀酰化在心脏代谢功能上的重要作用。同时也表明了蛋白质酰化修饰在心血管研究中的重要意义。 总结 上述三篇案例文章利用蛋白质组学或修饰蛋白质组学绘制了心脏各功能分区的蛋白质图谱，解释了蛋白质乙酰化或琥珀酰化修饰在心脏功能减退的作用机制。可见蛋白质修饰组学研究心血管疾病无疑是一个十分明智且潮流的选择，无论是用于发现心血管疾病的标志物或用药靶点，还是用于解释心血管疾病发生机制，甚至可以用于检验新的治疗手段。最后，呼吁大家响应国家号召，前赴后继投身蛋白质修饰研究。 参考文献 1、Doll S, Dreßen M, Geyer P E, et al. Region and cell-type resolvedquantitative proteomic map of the human heart[J]. Nature Communications, 2017,8(1). 2、Chi F L, Chavez J D, Garciamenendez L, et al. Normalization of NAD+Redox Balance as a Therapy for Heart Failure[J]. Circulation, 2016, 134(12):883. 3、Sadhukhan S, Liu X, Ryu D, et al. Metabolomics-assisted proteomics identifiessuccinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.[J]. Proc Natl AcadSci U S A, 2016, 113(16):4320. |
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