 全外显子组测序（WES）:一种利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。 由于其能以相对较低的检测成本，获得更加可靠的突变，创造更多的临床价值，受到了越来越多学者的喜爱，成为遗传病诊断的新秀。 但是，做WES的人多了，后续出现的问题也多了。Iasia老师最近就收到了很多客户的反馈，说是测完序后拿到一堆数据不知道该怎么做，挖掘不出更多更有价值的内容，想让我帮忙做更深、更全面的分析。 Iasia老师今天索性就以nature communication上的一篇文章为例，边解读文献边给大家讲一下做了WES之后应该如何解读数据，找出突变基因，获得更有价值的结果，发高分文章。  摘要 · 胰腺导管腺癌（PDA）是一种预后较差的恶性疾病，需要了解它的病因才能进行靶向治疗。将109例显微切割的PDA病例进行全外显子组测序，通过分析发现环境的压力、DNA修复基因的变异与肿瘤突变图谱具有相关性。 · 拷贝数的改变会靶向多个肿瘤抑制/致癌基因位点，但是只有MYC的扩增与不良预后和腺癌亚型是相关的。在PDA疾病中鉴定出多个新的突变基因，其中一部分基因对疾病的预后具有重要意义。 · 尽管具有侵袭性疾病的特征，发现RBM10突变与较长的生存期相关。在超过90%的病例中观察到KRAS突变，且编码Q61密码子基因与生存率增加相关。致癌基因BRAF突变与KRAS相互排斥，并对vemurafenib治疗PDA模型具有敏感性。 · 在Wnt信号通路、染色质重塑、Hedgehog 信号通路、DNA修复和细胞周期过程中有一些相关基因是高频突变。这些数据共同反应了PDA的基因突变多样性，为预后决定因素和治疗靶点提供了重要信息。 研究思路 作者对109例PDA/正常样本进行全外显子组测序，而后对数据进行解析，同时做了验证实验和功能研究。 整篇文章主要讲的内容都是生信分析，亮点也是在分析方法上的创新，所以特地选择此篇文章来讲高级生信分析。来学习一下作者的分析流程。  研究结果 TMB突变负荷 为了得到PDA患者样品中的肿瘤细胞，排除非肿瘤组织的影响，对109例手术切除的PDA病例采用针切法显著富集到来自周围微环境中的PDA肿瘤细胞后，进行了全外显子测序，这些样本具有相应的临床信息以及病理学特征。 在先前的测序PDA中，每个样本检测到的平均突变负荷是26个，与大多数实体瘤相比，突变负荷相对较低。在研究者的样本中观察到的平均突变负荷是每个样本为67个非同义突变，与多个其他实体瘤类型相似。  图1 109例临床信息以及病理学特征  图2 测序样本中的突变负荷。25%的突变负荷的样本的相关突变基因。通过超几何检验确定基因与突变负荷的关联性。 突变负荷和突变图谱的决定因素分析 与其它实体恶性肿瘤的相一致，具有最高突变负荷的样本在错配修复基因中有缺陷，与G>A,C>T碱基变化相关。  图3 不同程度突变的碱基变化的比较 根据样本的突变情况、肿瘤的分期、临床上的分级、吸烟与否进行分析，发现吸烟是一个重要的危险因素。吸烟者一般预后差，中位生存率为不吸烟者的一半，通过分析得到吸烟因素主要与碱基变换C>A颠换相关。   图4 吸烟与否的碱基变化比较 拷贝数变异与MYC的作用 通过对PDA的CNV进行AP算法聚类揭示了几个不同的变异模式（图5a、左），发现第5类群和第6类群相对于其它群体具有更多的扩增/缺失（图5a，右）。第5，6群的病例发现DNA修复缺失基因中除了TP53这个基因，其他基因在这两群中突变特异（超几何检验）（图5b），而且5，6两群的预后较差（图5c）。  图5 PDA中的拷贝数变异 通过GISTIC分析CNV的显著性区域，发现大量的癌基因（例如，MYC和CCND1）和肿瘤抑制基因（例如Smad4和CDKN2A）都具有显著性的扩增和缺失区域（图6d）。对这些区域与预后信息进行分析，发现只有MYC癌基因的8q24的扩增与预后相关（图6e）。虽然MYC过表达已被证明有助于胰腺癌在小鼠模型中的发生，但很少在患者标本中进行研究。MYC的扩增通过原位杂交法进行了验证（图6F）。虽然MYC扩增的病例不具有较高的突变负荷或与PDA的其他标志突变相关，但是在胰腺癌的腺鳞状亚型中扩增非常显著。  图6 PDA中的拷贝数变异 驱动基因分析与突变预后分析 MutSigCV分析109对PDA/正常组织样本，显示在超过3.5%的病例中有24个显著突变的基因（图7）。  图7 使用MutSigCV从109个测序的病例中确定SNV和INDELS的突变显著性 为了比较，研究者对先前测序的数据也进行了类似分析，显示仅有四个非同义突变。其中KRAS、TP53、CDKN2A和Smad4在之前多个研究中证实了促进PDA肿瘤发生的改变。大多数GNAS突变在热点密码子201（R201C和R201H），而且所有GNAS突变的浸润性癌病例来自一个共同的前体，导管内胰腺肿瘤（IPMN），从中还发现六个包含GNAS改变的PDA中，四个样本中有KRAS共同突变。 在6例和4例常规PDA病例中分别检测到两个突变基因（RNF43、RBM10），这两个基因在IPMN中同样是突变的。对这些基因进行预后分析发现RBM10基因发生突变会使预后变好，而ARID1A则相反。另外296个PDA病例的免疫组化分析结果表明，ARID1A蛋白的缺失与不良预后显著相关（图8） 图8 驱动基因分析以及相关基因的预后分析 KRAS通路的遗传多样性 PDA样本主要是以KRAS突变为主，可在92%的病例中检测到（图9a）。与其他测序研究一致， KRAS突变虽然有发生在密码子13和61中，但大多数发生在密码子12中（图9b和c）。密码子61处突变的样本相比较密码子12处突变的样本有更好的预后（图9d）。 图9 PDA中的KRAS / BRAF-Pathway 在RBM10突变肿瘤中观察到密码子61处KRAS突变的病例也表现出不良预后。当评估PERK染色时，密码子61的KRAS突变与其他突变相比ERK活性降低（图10）。这表明，在PDA中KRAS突变影响RAS通路激活和疾病的预后。 图10 PDA中的KRAS / BRAF-Pathway 在野生型KRAS的样本中发生的PIK3CA突变和BRAF突变被激活，富集在其他肿瘤类型中（图11）。在KRAS、BRAF和PIK3CA野生型的样本中也发现一些癌症相关基因（例如，STK11，GNAS, CHEK2 and 和RB1）。BRAF V600 E突变发生频率为3%且与KRAS突变互斥。虽然通过PDA的基因分析只能确定一小部分患者，但是可以进行KRAS/BRAF靶向治疗。 图11 PDA中的BRAF突变与所有癌症病例的分析结果比较 胰腺癌中经常发生突变的通路 除了核心KRAS通路，我们还发现在PDA中高频率(>20%)遗传变异的多种其他通路（图12）。除了Smad4的影响很大之外，TGF-通路也受其他基因的干扰，比如TGFBR2/TGFBR1 的缺失，以及ACVR1B的突变，这都是新的肿瘤相关基因。 图12 PDA中的通路 类似地，在RB通路中，CDKN2A和CDKN2B频繁缺失的同时， 也观察到CDK4和CCND1扩增和RB1缺失。在信号通路中，根据每个pathway的基因突变情况计算PDA样本中通路之间的相互关系来揭示通路之间的相互作用。（图13b）。 基于这些异常调节的通路中的CNA，用随机森林和AP聚类方法将PDA的样本分为多个亚型，从中发现异常调节的通路各种组合的多样性（图13c)。虽然单独的或与TP53联合的KRAS通路改变的肿瘤预后较差，但更复杂的通路异常调节的肿瘤趋向于更差的结果（图13d）。 图13 PDA中的通路 研究者通过数据分析表明PDA是一种遗传多样性疾病，包含与其他实体恶性肿瘤类似的突变负荷。 通过临床信息与突变信息的关联分析，以及聚类的方法将病人分成各种亚型找出多个之前在PDA中没有报道过的突变基因，这将有助于疾病建模和患者分类做个性化的治疗。 生信小知识 30秒知识点 AP聚类算法 (Affinity propagation Clustering Algorithm ） AP聚类算法是基于数据点间的'信息传递'的一种聚类算法。与k-均值算法或k中心点算法不同，AP算法不需要在运行算法之前确定聚类的个数。AP算法寻找的'examplars'即聚类中心点是数据集合中实际存在的点，作为每类的代表。 精神食粮还嫌不够足？〣( ºΔº )〣 明信社前两期关于高级生信分析的解读了解一下（直接戳链接就能进） |
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