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概念讲解 在平时研究基因功能过程中经常会用到RNA干扰(RNAi)技术，最常用的莫过于siRNA和shRNA了，那么这两种干扰技术有什么区别的，他们跟miRNA又是什么关系呢？ miRNA：MicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300~1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70~90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20~24nt的成熟miRNA。
shRNA：小发卡或短发卡RNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA，shRNA)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6启动子确保shRNA总是表达；shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。shRNA是由RNA聚合酶Ⅲ转录的，哺乳细胞中的shRNA产物有时会促使细胞产生干扰素反应(细胞遇到病毒侵袭时做出的自我防卫反应)，而miRNA却不会遇到这种问题(miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ转录，与转录mRNA的聚合酶相同)。shRNA也被用于植物和其它系统中，在这些系统中不需要U6启动子的驱动。在植物中，常用的增强表达的启动子是CaMV35S(cauliflower mosaic virus 35S),在这种情况下，RNA聚合酶Ⅱ参与了转录，起始RNA干扰。 siRNA：小或短干扰RNA(small/short interfering RNA, siRNA)是一类20-25个核苷酸长度的双链RNA分子，其主要在RNAi通路中起作用，干扰特异基因的表达。此外siRNA在RNAi相关的通路中也起作用，如抗病毒机制，基因组染色体结构的塑造等。其结构是一段完全互补的RNA双链，两端各有两个未互补的的碱基。
现在清楚他们之间的区别了么？之前我们曾为大家讲过《》今天我们就为大家讲如何10秒之内搞定shRNA的设计！ Sigma网站 Sigma公司做了一个针对人和小鼠的shRNA库，而且部分基因的shRNA序列经过验证，因此直接使用Sigma公司已验证过的RNAi序列最为方便。 首先进入网址：http:///S44oNe（由于原网址过长，所以我们为您提供了短网址地址，如若短网址失效，可以复制如下完整网址：http://www./china-mainland/zh/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-predesigned-sirna.html）
我们以PD-L1（CD274）为例，直接输入基因名PD-L1，点击Search，结果如下：
在Products选项中找到并点击shRNA选项，得到下列结果：
我们可以看到左侧SPECIES一栏有人和小鼠的，所以根据需要选择好种属，然后点击“MISSION®shRNA Plasmid DNA或者MISSION®shRNA Lentiviral Transduction Particles”这一行的价格（这套路太深了，o(╯□╰)o），这时会弹出针对目的基因的shRNA列表：
当你看到某条shRNA的Product Details下面出现时，恭喜你，这个shRNA有被sigma验证过，这种验证过的shRNA敲减效率基本上是有保证的。如果没有验证过的shRNA，则根据需要多选择几条shRNA也是一样能筛选到有效的靶点。小编倾向选择CDS区的shRNA，而且选择的每一条shRNA都会在NCBI上做BLAST，确保靶点是特异性的。当选定某个shRNA后就可以根据你所使用的载体来稍加修改送去合成了，sigma所使用的载体是pLKO.1，这也是小编经常使用的载体。所以sigma给出的序列是：CCGGCGAATTACTGTGAAAGTCAATCTCGAGATTGACTTTCACAGTAATTCGTTTTTG，这已经是sigma根据pLKO.1完善过的序列了，实际shRNA的序列应为： sense: CGAATTACTGTGAAAGTCAAT antisense: ATTGACTTTCACAGTAATTCG pLKO.1载体shRNA序列一般为： Forward oligo: 5’ CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTG 3’ Reverse oligo: 5’ AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense 3’ 所以你送去合成的oligo应为： Forward oligo: 5’ CCGG CGAATTACTGTGAAAGTCAATCTCGAG ATTGACTTTCACAGTAATTCG TTTTTG 3’ Reverse oligo: 5’ AATTCAAAAA CGAATTACTGTGAAAGTCAAT CTCGAG ATTGACTTTCACAGTAATTCG3’ 合成的Oligo经过退火等操作即可连入pLKO.1载体了，至于这个载体我们后期会推送专题文章进行介绍。 那么问题来了： 我的基因在sigma网站上没找到怎么办？！别急，下面的网站会解决你的问题！ ThermoFisher网站： ThermoFisher网站有个非常实用的在线shRNA设计软件，操作非常方便，而且设计出来的shRNA不再需要到NCBI上Blast，直接可以用的。 首先打开网址：http://rnaidesigner./rnaiexpress/，在Target Design Options处选中shRNA，如下图：
我们还是以PD-L1为例，Accession number处输入基因的NM号或在Nucleotide sequence处输入基因的CDS序列，『基因的NM号或者CDS序列都可以从PubMed上查找，我们在Step 3: Choose database for Blast处选择你基因的物种，其他条件不变，点击RNAi Design：
然后该软件就为您设计出了10条序列：
选择三条五星（shRNA星级越高代表越有可能有效）的shRNA，根据你的载体特点将序列稍微调整就可以送去合成了！怎么样，是不是很简单？网速手速够快，10秒钟绝对搞的定！ |
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