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PMID: 30377382 全外显子测序数据的解读非常复杂，相关疾病的致病突变的鉴定仍然是一个持续的挑战。阴性结果可能是由于技术方面的限制（包括非编码区和动态突变、覆盖度不够完整、单亲二倍体、大片段插入缺失、染色体重排、以及拷贝数变异）、基因与疾病之间的关联还不明确、表观遗传原因、多基因疾病或非遗传因素（毒素、缺氧、早产）。之前的研究表明重新分析数据可以增加10%-15%左右的额外阳性率，大部分是由于新发现的基因与疾病的关系、拷贝数变异，还有一种分析失败的可能原因是患者的表型没有充分理解与利用。本研究旨在评估临床医生对其患者全外显子组测序数据解读的贡献大小。
材料与方法 以色列中部Raphael Recanati Rabin医学中心遗传研究所，对于疑似遗传病的患者由临床医生评估送第三方检测机构检测分析，从2015年到2018年，114例患者外送，30例获得阳性检测结果，剩余84例阴性样本从公司要到原始数据，由临床医生自己根据患者电子病历分析候选位点。
结果 84例阴性案例的基本信息如下表，绝大部分是孩子，大部分的案例的临床表征都是神经发育方面的问题， 表1 患者信息总结
其中有10例在临床医生的分析下发现能够解释患者的临床表型，这些基因与疾病的关系在之前第三方检测出报告时就已经明确，具体见表2，游侠补充：非常有意思，在这篇文章里作者还对每个案例追问第三方机构为什么没有分析出来，非常值得大家关注与学习，下面我们就来看一看。
第一例患者主要表现为瘙痒症、胆汁淤积、肝脏活检有轻度纤维化、血清胆汁盐水平升高，一家三口全外显子检测，临床医生在SLC10A1基因上发现复合杂合突变，导致NTCP缺乏症，2014年9月就有文章发表这个基因与疾病的相关性，第三方检测机构建议的候选位点是ABCB4基因上一个杂合突变，并认为这两个位点在他们的数据库都有收录，SLC10A1基因最多算科研发现还不能作为临床诊断，作者认为阴性的原因是因为这个基因与疾病的关系在OMIM没有记录，游侠认为这个案例确实比较特殊，毕竟临床诊断参考的最重要的数据库就是OMIM，但是这也提示我们不能忽视其他文献证据。
第二例患者主要表现为语言和运动发育迟缓、先天畸形、肌张力低下、反射亢进，一家三口全外显子测序，临床医生在GNB1基因上发现一个新发的错义突变，遗传模式为AD符合，基因与疾病的关系是在2016年5月发表的，第三方检测机构没有建议候选位点，认为在出报告时GNB1的致病性研究还没有完全清楚，游侠认为这个案例说明报告新发突变的重要性，即使为阴性结果，但是由于新发突变非常罕见且一半确诊的遗传病都是由于新发突变导致，所以也应该在报告中体现。
第三个患者主要表现为肌张力低下、运动发育迟缓、眼球振颤、额骨凸起和双颞缩窄、父亲或母亲有房间隔缺损、血友病、双侧畸形足，一家三口全外显子测序，临床医生在ITPR1基因上发现一个新发的影响剪切突变引起Gillespie综合征，遗传模式为AD符合，基因与疾病的关系是在2012年2月发表的，第三方检测机构建议的候选位点是LAMA1基因上一个纯合突变，漏报的理由是上面的新发突变位点我们也发现了，但是由于该位点质量较低我们认为是假阳性位点所以没有报，游侠认为这个案例说明我们在初次分析阴性结果时需要放宽质控标准进行二次分析，而目前很少有机构能够做到这一点。
第四个患者主要表现为小头畸形、肌张力地下、严重整体发育迟缓、癫痫，单人全外显子检测，临床医生在MECP2基因上发现一个新发的错义突变引起新生儿严重脑病，遗传模式为X染色体显性符合，基因与疾病的关系是在2001年6月发表的，第三方检测机构建议的候选位点是TUBGCP4基因上一个纯合突变，漏报的理由是父母是近亲结婚主要寻找纯合致病突变，游侠认为不要被表象迷惑，各种可能性都有，近亲结婚除了关注纯合突变也要关注其他类型突变。
第五个患者主要表现为房间隔缺损、室间隔缺损、视网膜缺损、癫痫、海马回偏小、面部畸形、未存活，一家三口全外显子测序，临床医生在HNRNPU基因上内含子+5位发现一个新发的影响剪切突变引起早发性婴儿癫痫性脑病，RNA逆转绿确认该位点影响剪切，遗传模式为AD符合，基因与疾病的关系是在2013年5月发表的，第三方检测机构没有建议候选位点，漏报的理由是OMIM没有记载该基因与疾病的相关性。这个案例同样提示我们不能忽视其他文献证据。
第六个患者主要表现为大头畸形、癫痫、痉挛、听力受损、面部异常、肾积水、舅舅有智力低下但没有癫痫和痉挛，一家三口全外显子测序，临床医生在NFIA基因上发现一个新发的错义突变引起脑异常伴或不伴尿道缺陷，遗传模式为AD符合，基因与疾病的关系是在2014年1月发表的，第三方检测机构建议的候选位点是OFD1基因上一个半合子突变，漏报的理由是当时发报告的时候NFIA基因的临床表型不是很明确，这个案例提示在OMIM这个基因的临床表型描述不全，还需要细看这个基因的相关文献。
第七个患者主要表现为肌无力、髋脱位、室间隔缺损、未存活、腹股沟疝，母亲自闭症，父亲身材矮小、骨质疏松、一家三口全外显子测序，临床医生在FOXP2基因上发现一个遗传自母亲的无义突变引起语言障碍，遗传模式为AD符合，基因与疾病的关系是在2005年4月发表的，第三方检测机构建议的候选位点是B4GAT1基因上一个纯合突变，漏报的理由是家系成员情况复杂，三个人都有病且都不一样，没有报告FOXP2致病位点是在分析时患者还没有整体发育迟缓的临床表型，这个案例提示在复杂情况下第三方检测机构很难从临床表型加以判别，还得临床医生自己分析判断。
第八个案例，前一胎儿为母亲终止妊娠、囊性水肿、头部过度伸展，可能小颌畸形，小腿严重变形（胫骨/腓骨），有回声角状肋骨的畸形胸部，这一胎的表现仅囊性水肿及可疑的下肢畸形，父母及两个胎儿全外显子测序，临床医生在SOX9基因上发现一个新发的错义突变引起肱骨髁发育不良，遗传模式为AD符合，基因与疾病的关系是在1994年12月发表的，第三方检测机构没有建议的候选位点，漏报的理由是第二胎没有携带这个位点，在家系中没有共分离，软件预测4个只有2个认为有害，这个案例提示我们家系内类似表现患者可能是不同的突变导致的，第三方检测机构对临床表现错误解读了。
第九个患者主要表现为大头畸形、前额凸出、囟门延迟闭合、凹陷额嵴、眼距宽、内眦赘皮、3个牛奶咖啡斑，一家三口全外显子测序，临床医生在MID1基因上发现一个新发的移码突变引起Opitz G/BBB综合征，遗传模式为X染色体连锁，基因与疾病的关系是在1997年11月发表的，第三方检测机构没有建议的候选位点，漏报的理由是我们也发现了这个位点到考虑到这个基因是X染色体隐性遗传方式，而患者为女性所以没有报告，游侠认为这个案例提示即使女性患者携带X染色体隐性一个致病位点也需要考虑，因为女性有可能随机失活掉有完整功能的基因拷贝而表现临床症状。
第十个患者主要表现为听力下降、智力低下、鼻窦炎、大头畸形、小脑偏小、笨拙、腹泻、3-羟基丁基肉碱增高，单人全外显子检测，临床医生在GIPC31基因上发现一个纯合无义突变引起耳聋，遗传模式为AR符合，基因与疾病的关系是在2011年2月发表的，第三方检测机构建议的候选位点是POLE基因上一个纯合突变，漏报的理由是这个患者有很多临床表型，但是这个基因只能解释耳聋不能解释其他表型所以没有报告，游侠认为这个案例说明在分析数据时，在没有找到基因完整解释所有表型的情况下，解释部分表型的基因也应报告，但是考虑到相关基因非常多，建议只报告那些符合遗传模式的部分表型匹配基因。
另外还有3个案例的基因是在出报告之后与疾病关联的，如下表，总体上13/84(15.5%)获得了额外诊断。
讨论 当全外显子测序分析结果为阴性时，可以再用全基因组检测、基因芯片检测缺失与重复、RNA测序。本研究中临床医生分析的致病位点其实第三方检测机构也检测到了，10例中有4例是因为第三方检测机构对临床表型认识不足，其中两例是因为患者有了新的临床表型，1例是因为位点质量低被认为是假阳性位点，3例是因为基因与疾病的关联在OMIM数据库中没有或很少，1例（case4）是因为遗传模式的误判，1例（case2）是第三方检测机构的信息收集不完整导致的。
本文认为阴性案例重分析提高诊断阳性率的主要原因有两点，一是临床医生能够获取更详细的表型数据和患者图像，以及随时间变化的新表型；二是除了查询OMIM,还应详细查找那些符合遗传模式的罕见非同义突变基因的疾病相关性。 |
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