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对线粒体的认识，大家可能比较熟悉的是动物细胞内的主要产能中心，其实作为凋亡通路的中心环节细胞器，线粒体在细胞凋亡中还承担着不可替代的重要作用。 1960年，电子和氢离子传递过程中的磷酸化耦合机制被阐明后，线粒体作为ATP的生产场所被人们所熟知。30年后，线粒体以调节、执行细胞凋亡的新身份，再次受到广大研究者的高度关注，并逐渐成为凋亡通路中心的重要细胞器。它能够传递和放大死亡信号，是凋亡上游途径和Caspase途径以及其他下游死亡途径互相作用的中心环节。 线粒体由双层膜包围而成：外膜通过VDAC的介导，相较于内膜，对高至5000 Da的分子具有更强的通透性，但对膜间隙的促凋亡蛋白却不具有通透性；内膜包裹线粒体基质，呈嵴状折叠，在电化学梯度的驱动下，通过载体蛋白运输小分子。 图1 线粒体结构 研究表明，目前线粒体介导凋亡的途径主要有3种： （1）破坏细胞抗氧化的能力； （2）破坏电子传递链，扰乱氧化磷酸化过程，阻碍ATP的产生； （3）细胞凋亡的线粒体通路。下面主要介绍第3种途径。 Bcl-2家族蛋白根据其结构和功能的不同，可分为3个亚家族： （1）抑凋亡蛋白，Bcl-2、Bcl-xL等； （2）促凋亡蛋白，包含BH123结构域，成员有Bax、Bak等； （3）促凋亡蛋白，仅含BH3结构域，成员包括Bad、Bid、Bim等（如图2所示）。
正常情况下，Bcl-2、Bcl-xL与Bax、Bak形成异源二聚体，维持线粒体外膜的完整性，阻止线粒体凋亡反应。在凋亡信号刺激下，Bax和BH3蛋白的表达量增多，并与Bcl-2、Bcl-xL相结合，释放Bax/Bak，自由的Bax和Bak形成低聚物，释放Cyt C。
图3 Bcl-2家族蛋白的定位与功能。抑凋亡成员存在于线粒体外膜，促凋亡成员可在胞液并且可转移至线粒体膜。 Cyt C释放孔道是如何形成的呢？ 它与Bcl-2家族蛋白的作用和线粒体膜的变化密不可分。 Bcl-2、Bcl-xL、Bax等能够插入线粒体膜中，形成离子通道，改变膜的通透性。Shimizu等发现Bax可以通过与线粒体外膜的VDAC结合发挥作用，更有研究者在脂质体重建VDAC-ANT孔道研究中，发现Bax蛋白是孔道保持活性的必需组成。 另外，Bcl-2家族蛋白还可与其他孔蛋白相互作用，诱导线粒体通透性转变孔道开放，使胞浆和线粒体基质内的离子动态流动，例如：大量Ca2+流入胞质中，造成高渗状态，从而释放Cyt C。 与此同时，以上两种途径均可引起线粒体膜电位降低，膜电位的降低是细胞凋亡的特征性标志。另外，线粒体膜通透性的改变也会使呼吸链与氧化磷酸化失偶联，终止ATP的合成，最终导致细胞走向凋亡。 自1990年Bcl-2蛋白在线粒体膜中被发现，便开启了线粒体调节和执行哺乳动物细胞凋亡的研究大门。在接下来的几年间，多种激活凋亡的线粒体蛋白被陆续发现和证实，这些蛋白通常存在于线粒体膜间隙，受到凋亡促进因子刺激后，释放到胞质中，介导凋亡的执行。 Cyt C作为载体，能够在线粒体呼吸链中传递电子，建立线粒体的跨膜电位，并产生ATP。当Cyt C缺失或者功能障碍，会使呼吸链功能异常，ATP生成受阻，导致细胞凋亡。 当受到促凋亡蛋白诱导后，Cyt C从线粒体膜间隙释放到胞质中，与Apaf-1结合，激活Apaf-1的核苷酸交换活性，此时ADP/dADP关联的非活性Apaf-1变为与ATP/dATP结合的活性Apaf-1，并形成轮状复合体，继而募集Caspase 9酶原，形成凋亡体，并启动下游Caspase级联反应。
图4 Cyt C的释放。Cyt C从膜间隙释放，形成凋亡体，启动Caspases 参与线粒体介导的促凋亡蛋白除了Cyt C，还有AIF、SMAC、Omi/HtrA2、Endo G等，在凋亡期间，这些蛋白也是从线粒体膜间隙释放至胞液。其中，SMAC、Omi/HtrA2可结合IAPs，对抗IAPs对Caspase 3、9的抑制，属于Caspase依赖型蛋白；AIF、Endo G可转位至细胞核，使染色质凝缩、大规模DNA片段化，属于非Caspase依赖型蛋白。 Caspases分布于胞质内，是具有相似结构的半胱氨酸蛋白酶系，在参与介导细胞凋亡中起着重要的作用。正常状态下，Caspases都维持着不具有功能活性的酶原状态，受到凋亡诱导因子刺激时，酶原被激活成活性Caspase，执行凋亡。 目前，研究显示与线粒体关系最为密切的是Caspase 3和Caspase 9。并且普遍认为主要有2种途径活化Caspase 3和Caspase 9： Cyt C从线粒体释放至胞质，与Apaf-1、Caspase 9酶原结合形成凋亡体，活化Caspase 3。 线粒体跨膜电位下降时，不仅仅释放Cyt C，也会释放凋亡诱导因子AIF，AIF在胞质中能够直接激活Caspase 3，继而活化Caspase 9。 异常凋亡性细胞死亡是肿瘤发生和进展的标志之一，癌细胞利用多种机制来解除线粒体通路的正常运行，导致凋亡受阻，进而获得自身生存优势。 那么，对线粒体通路进行靶向作用，成为治疗癌症的途径之一。目前，大量的药物研究致力于靶向作用Bcl-2家族成员，其中第一个临床试验制剂—奥利默森钠（oblimersen sodium），可结合人类bcl-2 mRNA，使其降解。其他靶向思路也包括开发BH3类似化合物，恢复突变体p53的活性，阻止IAP蛋白活性（如：SMAC类似物），开发Caspase 3激活试剂（如：经高通量筛选出的PETCM、GA、MX-206）等（如图5）。且越来越多的研究表明，联合疗法能达到更好的治疗效果。
除了癌症之外，还有其他与线粒体有关的疾病，例如：研究者发现在帕金森病患者黑质神经元中检测到神经元内线粒体的衰退和COX活性的降低，在线粒体脑病和肌萎缩性侧索硬化等患者的脑区域中也检测到脑组织伴有COX的缺失。 由此可见，线粒体与细胞凋亡进程密切相关。在药物诱导肿瘤细胞凋亡的信号转导过程中，线粒体在促进凋亡信号和Caspase激活之间起着不可替代的作用。线粒体通路的重要性不仅体现在正常发育、组织稳态的维持、免疫系统的调节，也体现在免疫失调、神经退行性变、癌症等人类疾病中。 既然线粒体的作用如此重要，我们对它的研究自然是必不可少的。在进行众多凋亡实验中，对线粒体的分离是十分基础和重要的步骤。 全式金自主研发的两款线粒体分离试剂盒：ProteinExt® Mammalian Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells和ProteinExt® Mammalian Mitochondria Isolation Kit for Tissue，提供了两种方法（试剂法和匀浆法）用于高效、快速地从哺乳动物细胞或组织样品中分离线粒体。同匀浆法相比，试剂法的提取过程更温和，可以最大限度地降低对线粒体的损害，并且可以同时处理多个样品。 流程：收集细胞或研磨组织→裂解细胞浆膜→去除细胞碎片→收集线粒体→润洗线粒体。 产品具有以下优势： ● 提供的试剂法线粒体提取方法非常温和、无需进行匀浆，可以最大限度地降低对线粒体的损害； ● 提取的线粒体量高，与Pierce持平（见图产品优势1）； ● 试剂法可以同时处理多个样品（匀浆法每次只能处理一个样品）。 ● 分离出的线粒体完整性良好，可用于蛋白检测、细胞凋亡、信号转导及代谢研究等实验（见图产品优势2）； ● 本试剂盒具有分离效果好、操作简便、快速等优点。 产品优势1：线粒体提取量高
产品优势2：线粒体完整性良好
需要注意的是： ◆ MIBI、MIBIII和MSB使用前需加入ProteinSafeTM Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free（100x），使其工作浓度为1x。 ◆ 所有操作均需在冰上或2-8 ℃进行。 ◆ 采用匀浆法时，需自备1-2 ml玻璃匀浆器，匀浆次数随细胞和细胞数不同而不同。 ◆ 如需进行下游功能检测，则要使用新鲜的细胞样品或组织样品进行线粒体提取。 对线粒体的研究，有助于细胞凋亡通路的深入探索，应用于临床，则体现在疾病的治疗、靶向药物的研发等领域，所以具有十分重要的意义和价值。 下期我们将探讨细胞凋亡的研究热点领域，希望大家及时关注，祝大家科研顺利！  [1] Xiong, S.B., et al., 2014. Mitochondria-mediated apoptosis in mammals. Protein & Cell, 5(10), 737-749. [2] Mohamad, N., et al., 2005. Mitochondrial apoptotic pathways. Biocell, 29(2), 149-161. [3] 陈国元，王为，张振. 线粒体在细胞凋亡中的作用的研究进展. 国外医学（医学地理分册），2014，35（2）：85-88. [4] 王佺荃，张文丽，元小冬，彭伟，骆泓洁. 线粒体在细胞凋亡中的作用. 中国医学创新，2015，12（6）：143-146. 市场部 种欢夏 ▏文案 市场部 刘婷婷 ▏编辑 |
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