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一种新的FLI 1外显子circRNA通过协同调控TET 1和DNMT 1促进乳腺癌转移 A novel FLI1 exonic circular RNA promotes metastasis in breast cancer by coordinately regulating TET1 and DNMT1 期刊：Genome Biology 影响因子：13.214 通讯作者单位：吉林大学第一医院 来自吉林大学第一医院与斯坦福大学医学院的研究者最近在Genome Biology（IF=13.214）上在线发表了题为A novel FLI1 exonic circular RNA promotes metastasis in breast cancer by coordinately regulating TET1 and DNMT1的研究，介绍了FLI1外显子circRNA（FECR1）作为上游调控因子通过协同调控DNA甲基化和去甲基化酶，起到控制乳腺癌肿瘤生长的作用。进一步表明FLI1不仅通过经典的癌蛋白途径驱动肿瘤转移，还通过其外显子circRNA介导的表观遗传机制来驱动肿瘤转移。 CasIP鉴定出了一种新的FLI1外显子circRNA 作者通过免疫组化染色检测了乳腺癌组织及相应癌旁组织中FLI1的表达发现，对比癌旁组织，乳腺肿瘤组织中FLI1明显活化（图1 A，B；红色箭头）。为了明确在乳腺癌中异常调节FLI1的分子组成，研究人员采用了一种新颖的CasIP方法免疫共沉淀FLI1启动子染色质复合物（图1C）。研究人员猜测鉴定参与基因启动子中染色质相互作用网络形成的组分可能提示肿瘤中异常FLI1活化的潜在机制。研究者构建了一个包含催化失活CRISPR Cas9 （dCas9）和两个FLI1启动子gRNA的慢病毒载体（图1D），并将其转染进MDA-MB 231乳腺癌细胞。通过Cas9免疫沉淀测序，研究人员发现了一种新的FLI1 circRNA并将其称为FECR1 （FLI1外显子circRNA），它与FLI1的启动子相互作用。利用CasIP PCR证实了FECR1与FLI1启动子的相互作用。同时发现转染了Cas9- FLI1 gRNA的乳腺癌细胞中，FECR1富集（图1E），而转染Cas9 control gRNA的细胞（gCT）中，未检测到CasIP信号。在IgG对照和非抗体对照（nAb）中均未检测到FECR1信号。因此，FECR1特异性地与乳腺癌细胞中的FLI1启动子相互作用。  图1：Cas9IP法鉴定FLI 1 circRNA FLI 1 circRNA来源于4号外显子和2号外显子之间的反向剪接 为了描述这个新发现的circRNA的结构，使用一对circRNA特异性PCR引物来扩增覆盖反向剪接位点的cDNA片段(图2A)；这些引物不会扩增线性FLI1 mRNA。为了证实FECR1的循环性，研究人员对MDA-MB231肿瘤细胞的总RNA进行RNase R处理，RNase R专门消化线性RNA。RNase R消化后，用FECR1特异性PCR引物检测circRNA的表达。去除线性RNA后，仍然在MDA-MB231细胞和过表达FECR1的MDA-MB231细胞中检测到FECR1的存在(图2B)。FLI1线性mRNA被RNase R消化，PCR只检测到非常弱的单链。这些数据进一步证实了FECR1是一种circRNA。 为了进一步表征FECR1，作者们利用circRNA测序数据库对FECR1 circRNA进行分析。分析显示，FECR1 V1变体是由FLI1外显子4和外显子2之间的反向剪接形成的，V2变体是由外显子5和外显子2连接而成(图2C)。由于V2变体的丰度太低，本研究主要关注的是V1变体，并利用RT-PCR检测了FECR1在其他乳腺癌细胞系和乳腺癌患者手术组织样本中的表达（图2D，2E）。  图2：FECR1与乳腺癌的发生发展有关 FECR1促进肿瘤细胞侵袭 为了表征FECR1的生理功能，构建了慢病毒表达载体过表达FECR1。这一表达载体由携带剪接受体序列的内含子1序列的一部分，外显子2，外显子3，外显子4和含有剪接供体序列的内含子4的一部分组成，由CMV启动子控制。利用DsRed荧光标记物追踪载体中FECR1的表达情况(图3A)。经嘌呤霉素筛选，筛选出稳定的克隆。RT-PCR显示与载体对照相比，转染细胞中FECR1过表达(图3B)，定量PCR也验证了这种circRNA的过表达(图3C)。研究人员发现利用小干扰RNA敲低FLI1可显著降低高转移性人乳腺癌细胞的侵袭潜能。因此，作者检测了FECR1的增加是否增强了细胞的侵袭。如图3D，E所示，与载体对照相比，FECR1的异常表达增强了细胞的侵袭能力。这些数据表明，与FLI1一样，FECR1 circRNA也具有促进乳腺癌细胞转移的能力。  图3：FLI 1 circRNA促进乳腺癌细胞的侵袭 RNA逆转录相关捕获法识别 FECR1靶基因 当FECR1与FLI1启动子结合时，FECR1在MDA-MB 231肿瘤细胞中的细胞分布被检测。分离细胞质RNA和核RNA，进行逆转录。然后使用RNA逆转录相关捕获 (RAT)实验来识别除FLI1启动子外，与FECR1相互作用的靶基因网络(图4A)。然后设计了一系列PCR引物覆盖FLI1基因位点(图4B)，并检测了FECR1的结合位点。最终发现FECR1主要与FLI1的启动子结合(图4C)。circRNA未与远端内含子区域(I1 -I3)和5’ -上游控制区(5’ -CT)结合。为了确定FECR1是否影响FLI1的活性，作者使用两对PCR引物(外显子4- 6和外显子3- 4)来定量表达FECR1的细胞克隆中FLI1的表达。结果显示，与PBS和载体对照相比，circRNA的异常表达显著上调了FLI1的表达（图4D）。Western blot显示在处理后的细胞中，过表达FECR1显著上调了FLI1的表达(图4E，F)，这些数据表明，FECR1与FLI1的启动子结合，激活了基因转录。  图4：FECR1上调FLI1的表达 FECR 1诱导FLI 1启动子中大量的CpG DNA去甲基化 然后研究者对这种circRNA上调FLI1的表观遗传机制进行了研究。为了了解FLI1启动子是否受到FECR1表观遗传学调控，作者重点研究了FLI1近端启动子中CpG岛的甲基化状态(图5A)。通过亚硫酸氢钠测序评估FLI1启动子中的DNA甲基化。亚硫酸氢盐处理后，分别用3种限制性内切酶（TaiI、Bsh1236I、BstB1）对甲基化和未甲基化的CpGs进行区分(图5B)。亚硫酸氢盐处理将未甲基化的CpGs转化为TpGs，TpGs不会被这些酶切割。结果显示与载体对照相比，FECR1诱导大量的DNA去甲基化，而启动子中大量的DNA去甲基化与表达FECR1的肿瘤细胞中FLI1的上调有关。  图5：FECR1诱导FLI1启动子中的DNA去甲基化 FECR 1通过协同调控DNMT 1和TET 1促进肿瘤转移 随后作者关注了FECR1激活FLI1的表观遗传分子机制。DNMT1是哺乳动物DNA甲基化维持所必需的关键甲基转移酶。它主要催化半甲基化CpG二核苷酸的甲基化。考虑到FECR1诱导FLI1启动子中的DNA去甲基化，作者检测了DNMT1是否参与了这一表观遗传控制过程。作者首先分析了FECR1 RAT测序数据，发现FECR1富集于DNMT1启动子区域(图6A)，且该区域组蛋白3赖氨酸27 (H3K27)高度乙酰化。然后定量测定了DNMT1在处理细胞中的丰度。结果表明，与对照组相比，FECR1异常表达显著降低DNMT1 在mRNA水平的表达(图6B)。这些数据表明，FECR1与DNMT1启动子结合，下调DNMT1转录。 一个特定基因启动子中DNA甲基化的状态也由TET1（一个Fe(II)/2-氧戊二酸依赖性双加氧酶）决定。TET1是诱导活性DNA去甲基化的氧化脱胺机制的关键因子。为了确定FECR1与FLI1启动子的结合是否会调节这一去甲基化过程，作者使用RNA -染色质免疫沉淀(RIP)法来拉下与TET1相互作用的复合物。拉下来的RNAs再利用FECR1特异引物进行逆转录和PCR定量。结果显示TET1抗体沉淀复合物中富集了FECR1(图6C)。综上所述，FECR1 circRNA可能通过与基因启动子结合并招募TET1 DNA去甲基化酶诱导DNA去甲基化来调控其靶基因，如FLI1。  图6：FECR 1协同调控DNMT 1和TET 1 总结 总之，该文献报道了一种新的与FLI1启动子相互作用的FLI1 circRNA （FECR1）。这一FECR1与FLI1启动子结合，并招募TET1去甲基化酶诱导DNA去甲基化，从而调控靶基因的表达。因此，这种circRNA可能通过协调参与肿瘤生长的靶基因中的DNA甲基化和去甲基化来调节乳腺癌细胞的转移。因此，FLI1 circRNA有可能成为转移性乳腺癌治疗干预中的潜在治疗靶点。  永 诺  广州永诺生物科技有限公司成立于2010年，总部位于广州国际生物岛，是一家专注于医学科学技术开发与服务、分子诊断产品研发与生产的高新技术企业。永诺生物将秉承“扎根于华南，产学研互动，以需求推服务，以市场出产品，以成果促转化，以创新领先进”的企业理念，以及“以人为本、参与创造、释放激情、共创未来”的人才战略，耕耘于医学领域，奉献于医疗卫生事业。 公司目前占地面积3000²，硕、博士以上学历员工占比近40%，团队骨干曾参与多项国家973,863肿瘤研究项目，具备丰富的科研和产品开发经验，已建立包括基因组高通量测序、分子细胞功能实验、病毒构建包装和动物疾病模型等在内的一整套研发、生产技术体系平台。公司依托先进的技术力量以及具有竞争优势的人才储备，建成符合国家标准的屏障级实验动物中心500²、常规分子实验平台500²、医学检验实验室1000²、办公场所1000²。并于同年获广东省卫生与计划生育委员会批准建立第三方医学检验所—广州永诺医学检验所，2018年获得广东省动物协会授予的动物使用合格证。  |
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