荧光定量小课堂 | 从萌新到大神，一招教你设置qPCR阈值线

千呼万唤！首爆预告~

2019蜘蛛侠带矿回归

英雄荷兰弟霸气登场

全新战服酷炫亮眼神秘强大

经历了第一部的蜕变和复联系列被虐后的成长

小蜘蛛又会面临怎样的危机？

大反派“元素众”预告现身，由未知宇宙四名操控元素的顶尖高手组成，分别是操控火焰的地狱火、操控水流的海昌、操控大地的玛格南和风之主宰西风。最最惊喜的是身穿中世纪铠甲，手中放射绿色光的神秘客震撼亮相，和小蜘蛛一起并肩作战打败元素怪物！

此次蜘蛛侠将前往欧洲展开新的征程，并将对抗由杰克·吉伦哈尔加盟饰演的大反派神秘客，赞达亚、雅各布·巴特朗、托尼·雷沃罗利等原班人马也将悉数回归。

小蜘蛛即将踏上属于他的新征程，小编也将带领大家开启本次全新荧光定量小课堂！DougRains教授将为大家解答关于设置阈值线的相关问题。

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今天小问题是：什么是阈值线，我应该把阈值线设置在哪里？这个问题问得非常好。阈值线是与扩增曲线相交的一条水平线，可以沿着Y轴方向上下移动。

那它的作用是什么？我们稍后会看到，软件是在哪儿设定阈值线的。

当然，不是Y轴上所有的地方都可以的，有些区域不是很合适。比如，阈值线不能太低，否则就会受到噪音信号的干扰。反之，如果阈值线设置的太高，到达扩增线性期或平台期，那这时的数据就是不准确的。

那阈值线设置在哪儿最好呢？其实阈值线应该设置在扩增曲线接近线性和线与线之间相互平行的位置。对于实验来说最好是将阈值线设置在样本重复性最好的区域。这通常是在指数扩增期的中期或后期。

不过无论在什么时候，当有了性能卓越的反应预混液，得到一个好的实验结果就会非常容易。对于所有Applied Biosystems™荧光定量PCR软件，默认都是自动设置阈值线。

就是说，当我们点击Analyze（分析）按钮时，软件会自动为我们的实验设置好最佳阈值线。请注意，我们的软件会分别为每种Assay单独设置阈值线。这是非常必要的，因为不同的assay的最佳阈值线是不同的。

当然只要我愿意，可以把阈值线设置调整为手动模式，然后用鼠标进行上下调整。当阈值线设定好后，我们点击分析按钮，就能得到所有样本的Ct值了。

细心的同学可能会问：如果阈值线可以向上或向下移动，那Ct值会不会随之变动么？答案是“会的”。但是实际上，只要将阈值线设定在合适的范围内，任何两个样品间的相对Ct值或△Ct值都会保持不变。这也让我们可以依据相对Ct值或△Ct值来计算不同样本间基因表达量的倍数变化，也可以用标准曲线进行绝对定量分析。

以上就是今天的内容。如果您有任何关于荧光定量PCR的问题，请Ask TaqMan吧。

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