|
>>>ctDNA/cfDNA片段长短分布及原理(上) 每周新知  ▲上期回顾 （点击图片可看大图，下同） 前言 肿瘤精准诊疗的关键目标是改善癌症的诊断和治疗，由于肿瘤组织检测存在临床上难以获取组织（如组织样本量不足、由于发生骨转移或者脑转移而很难获取组织或无法获取组织样本等）以及空间/时间/结构/功能异质性等局限性因素，而液体活检因不具备侵袭性，且可以在疾病治疗的不同阶段重复进行，使得目前肿瘤精准诊疗的焦点转向液体活检。 液体活检的分析物包括（见图1）：
 ▲图1 液体活检的分析物 以高通量捕获测序为基础的ctDNA检测可以实现无创、实时、全面的揭示全身多病灶突变信息。 ctDNA在精准肿瘤学中的潜力 研究表明，ctDNA可能来自凋亡细胞，因此其可能代表肿瘤细胞的特定亚型。但也有研究认为，ctDNA提供了肿瘤基因组的全景视图，因为它反映了从多个肿瘤区域或不同肿瘤病灶释放的DNA信息，对ctDNA的分析可以发现组织活检中无法发现的体细胞突变。 随着测序技术的发展，如今的深度测序已经能够满足评估肿瘤内异质性和亚克隆突变的需求，并且能够揭示具有不同基因组特征的特定分子亚型。事实上ctDNA检测分析可以实现肿瘤患者的全程诊疗管理（见图2）。  ▲图2 ctDNA检测可实现肿瘤患者的全程管理 ctDNA因具有以下优点而能够成为精准肿瘤学的潜力标志物：
 ▲图3 ctDNA作为精准肿瘤学生物标志物的潜力 ctDNA在精准肿瘤学中的挑战 然而，ctDNA在精准肿瘤学中的应用中也面临很多困境和挑战。 目前公布的ctDNA检测数据主要集中在主流癌种，如肺癌和结直肠癌，而针对发病率偏低的癌症类型其研究相对较少。另，作为检测金标准的肿瘤组织，临床上也面临着ctDNA与组织一致性的比较，它们有各自的特点（见表1）。 表1 组织活检与ctDNA检测特点对比  *：解卷积（Deconvolution），是指从异构样本中提取细胞类型特异性信息的过程。 在液体活活检中，这可能涉及将血浆DNA片段分解成其构成要素（例如，基于甲基化标志物确定其组织起源）。 2016年发表在Sci Rep.的一篇研究，采集了30例Ⅰ~Ⅱ期和11例Ⅲ~Ⅳ期非小细胞肺癌患者的术前0~13天（平均3.9天）外周血、手术组织和术后2~10天（平均5.1天）外周血样本，使用CA50 panel（包含了50个与肿瘤用药、致癌基因通路及肿瘤检测相关基因的2856个热点突变，通过Ion Torrent Proton检测平台、深度测序（>10,000x），对血浆ctDNA和组织tDNA突变情况进行了比较。 研究显示，检测到30例早期（Ⅰ-Ⅱ期）非小细胞肺癌患者血浆ctDNA的常见驱动突变，并且与组织tDNA高度一致，其中，一致性为80.0%，敏感性为75%，特异性90%，阳性预测值93.8%（见图4）。  ▲图4 早期血浆ctDNA与组织tDNA一致性分析 ctDNA 的检测另难点之一是：血液中的ctDNA通常在数量上远远少于非癌cfDNA，因此分析ctDNA时的瓶颈问题在于如何从正常细胞cfDNA背景下检测到罕见的ctDNA片段。 ctDNA具有高度碎片化的特点，在血液中是以裸露核酸的形式存在，这也从另一个侧面提示它们可能源于凋亡进程中核小体所含的核酸片段。 研究表明，cfDNA的半衰期仅有1~2个小时，在外周血中处于一个动态的不断变化的过程，其表达量取决于产生cfDNA的来源。血浆中总cfDNA含量低，且ctDNA仅为cfDNA中很小的一部分，虽然ctDNA在cfDNA中的占比波动范围非常大，但实际上大多数ctDNA在cfDNA中的占比~0.2%。 在检测中一般是通过进一步提高分析灵敏度来解决上述问题。临床实践中的解决方法之一是通过显着增加样本体积（即采集肿瘤患者更多的血液）来增加可检测分子的数量，但这种方法在晚期疾病患者中通常不具有临床可行性；或者通过大量血浆样本突变检测来确定被定义为肿瘤突变阳性所需的最小检测突变数，从而弥补ctDNA的低起始量。 解决ctDNA低起始量的最新技术发展集中于提高测序方法的分析灵敏度上，但这可能受到血浆cfDNA提取、测序文库制备、测序过程中引入错误等影响。例如：在对特定的基因组区域进行文库捕获和富集过程中可能引起DNA的氧化损伤从而导致序列的改变；测序灵敏度受到测序精度和所选用方法的覆盖率影响等。通常使用UMIs (unique molecular identifiers/barcodes)可以减轻这些因素带来的问题。靶向错误校正测序（TEC-Seq，Targeted Error Correction Sequencing）是一种基于UMI的测序方法，可检测结直肠癌，肺癌，卵巢癌和乳腺癌患者血浆ctDNA中的常见突变基因，其中，超过75％的患者可以检测到至少1个突变。 其他增加分析灵敏度的尝试集中在基于ctDNA/cfDNA的长度来富集ctDNA片段。 近年来许多研究表明，ctDNA和cfDNA的片段长短存在差异，有研究报道它们比来自正常细胞的cfDNA（~166bp）更短，为（132~145bp）。 最近的一项研究报道是将血浆cfDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后切除胶上适当大小的DNA条带，通过DNA凝胶回收操作以富集ctDNA。然而，靶向单链cfDNA（通常比双链DNA短）不会导致肿瘤DNA片段的富集。 此外，有研究报道，在结直肠癌和乳腺癌高ctDNA水平的患者中，长度>320bp的二聚核小体（dinucleosomal）DNA片段频率增加。 最近的一项研究表明，DNA片段长度可能因核小体在原始组织中的可及性而产生差异。如，相较于胎盘细胞，白细胞将核小体核心中的不同位置暴露于核酸酶活性，因此胎盘细胞显示出比白细胞更高的核小体可及性，这可能解释了为什么怀孕女性血浆中的胎儿DNA比其cfDNA片段更短。 如果在癌细胞中运行类似的机制，对DNA片段长度的测量有可能区分血浆中各种细胞来源的DNA。当然需要更多的研究工作来进一步确定是否可以基于这种可能的片段大小差异来选择特定的cfDNA亚群。 以上内容根据笔者自己的理解进行整理，若有疏漏异议，欢迎大家留言指正 主要参考文献： (1) Heitzer E. et al．Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.Nat Rev Genet (2018). (2) Wan JCM. et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA.Nat Rev Cancer. 17(4):223-238 (2017). (3) Guo N. et al.Circulating tumor DNA detection in lung cancer patients before and after surgery.Sci Rep. 19;6:33519 (2016). (4) Heidary, M. et al. The dynamic range of circulating tumor DNA in metastatic breast cancer. Breast Cancer .Res. 16, 421 (2014). (5) Heitzer, E. et al. Establishment of tumor- specific copy number alterations from plasma DNA of patients with cancer. Int. J. Cancer 133, 346–356 (2013). (6) Phallen, J. et al. Direct detection of early- stage cancers using circulating tumor DNA. Sci. Transl Med. 9, eaan2415 (2017). (7) Sun, K. et al. Size- tagged preferred ends in maternal plasma DNA shed light on the production mechanism and show utility in noninvasive prenatal testing. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, E5106–E5114 (2018) . 每周讨论 上期讨论解答 讨论：目前单细胞测序技术还在发展阶段，因为其涉及到NGS技术，有哪些技术问题是仍需要解决的呢？ (1) 目标细胞的提取问题：要能够准确筛选目标细胞，如正常细胞或肿瘤细胞不被周围细胞污染； (2) 扩增失败和等位基因脱扣； (3) PCR产生的非特异产物问题； (4) NCS的重复性问题； (5) 如何降低测序成本问题等。 本期Topic 讨论： (1) 传统的cfDNA片段大小研究方法是怎样的？ (2) cfDNA片段长度及分布有何规律？ |
|
|
