胎儿异常综合征的外显子组测序：新型表型 - 基因型发现

摘要

大多数严重胎儿异常综合征的单基因病因尚不清楚。我们的目标是使用外显子组测序（ES）来增加我们对因果变异和与特定胎儿表型相关的新候选基因的了解。我们在一个由19个家庭组成的队列中使用ES，其中一个或多个胎儿表现出独特的异常模式和/或表型复发，其致死结果的风险增加。在12个家庭中确定了候选变异体（63％）; 其中6个确实得到了明确的诊断，包括公认的疾病基因（MKS1 ，OTX2，FGFR2和RYR1）的已知或新型变异，以及描述新胎儿表型的新疾病基因的变异（CENPF，KIF14））。我们在临床和功能评价（SMAD3，KIF4A和PIGW）后鉴定了可能导致变异的变异，并提出了由功能和跨物种表型证据支持的早期人类发育疾病的新候选基因（PTK7，DNHD1和TTC28）。我们描述罕见和新颖的胎儿异常综合征，并突出ES的诊断效用，但也有其对发现的贡献。产前ES的未来应用的诊断产量将取决于我们增加我们对胎儿发育期间特定表型 - 基因型相关性的知识的能力。

介绍

出生缺陷是工业化国家围产期致死率的主要原因[ 1]。随着高分辨率超声的发展，胎儿结构异常现在在怀孕期间越来越早被发现，这引起了对父母和医疗保健提供者的诊断，病因，预后和复发风险的质疑，特别是在存在多个胎儿异常的情况下可能表明先天性畸形综合征。产前高分辨率染色体微阵列分析将允许在排除频繁的非整倍性后诊断多达10％的妊娠中的因果拷贝数变异，但80-90％的家庭仍未确诊。如果基于临床症状怀疑特定的单基因实体，则可以指示有针对性的分子检测。2 ]。外显子组或基因组方法现已在常规临床遗传学服务中用于诊断患有发育障碍的患者。然而，直到最近，胎儿异常表型的描绘受到越来越多的关注，包括在标准产前护理中引入外显子组测序（ES）的讨论。Best等人。[ 3 ]讨论了它的承诺和陷阱，包括审查了31个系列的五个或更多胎儿的诊断率，诊断率在6.2％到80％之间。这些研究的方法是高度异质的，从预期的产前ES到终止或死产后严重胎儿异常的选定病例的研究[ 4]]。一般而言，具有多个先天性异常的胎儿的诊断产量似乎更高，并且在具有详细临床遗传学综述的选定系列中[ 3 ]。然而，在产前发育阶段遇到的显着比例的异常表型可能对胎儿生命具有特异性，因为它们将导致胚胎，胎儿或围产期致死，并且迄今为止将逃避病因学研究和临床描述。它们还可以代表在出生后描述的表型的不完整或严重的等位基因呈递，因此在该发育阶段诊断仍然未被识别。Filges和Friedman [ 5]强调应用基因组测序来检验这种罕见的极端表型的价值，尽管在解释变异的临床意义和证明其因果关系时会遇到挑战。基于这些考虑因素，我们在一系列具有一个或多个具有严重结构异常的胎儿的19个家族中探索了使用ES的临床和分子诊断。我们的目的是确定因果和候选变异，显示ES用于诊断和发现的效用，并试图促进胎儿阶段已知和新型多发性先天性异常综合征的表型呈现的进一步描述和病因学，旨在增加未来产前诊断ES的产量。

患者和方法

该研究得到了瑞士西北部伦理委员会的批准（EKNZ 2014-174）。在获得父母参与的书面知情同意后，我们前瞻性地招募了19个家庭--26个胎儿（胎儿或围产期死亡或终止妊娠后）和一个孩子 - 出现了最初通过超声扫描确定的不明原因的严重异常。家庭被纳入研究中，如果（i）胎儿表现出两种或两种以上与胎儿或围产期致死率高风险相关的异常模式，表明遗传性疾病或（ii）胎儿异常表型的家族性复发，如果（iii）有详细的临床胎儿超声和/或尸检数据和（iv）高分辨率染色体微阵列未显示因果染色体异常或拷贝数变异。家庭是通过瑞士巴塞尔大学医院的医学遗传学诊所招募的。胎儿表型由经验丰富的临床遗传学家，胎儿和神经病理学家以及母胎医学专家进行评估。在18个家庭的受影响的胎儿中进行尸检。家庭是通过瑞士巴塞尔大学医院的医学遗传学诊所招募的。胎儿表型由经验丰富的临床遗传学家，胎儿和神经病理学家以及母胎医学专家进行评估。在18个家庭的受影响的胎儿中进行尸检。家庭是通过瑞士巴塞尔大学医院的医学遗传学诊所招募的。胎儿表型由经验丰富的临床遗传学家，胎儿和神经病理学家以及母胎医学专家进行评估。在18个家庭的受影响的胎儿中进行尸检。

外显子组测序（ES）和变异优先排序

从先前的产前标本中使用基因组DNA，所述标本从绒毛膜绒毛取样，羊膜穿刺或从新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）胎儿组织中提取。从全血样品中提取亲本DNA。ES是在家族三人组（或复发后可用的quattros）中进行的。使用Agilent SureSelect XT Human All Exon V6（Agilent，Santa Clara，CA）进行文库制备（Agilent SureSelect XT文库制备试剂盒）和外显子组捕获，然后在HiSeq 2500上进行配对末端读取测序（2×100 bp读取长度）或HiSeq 4000平台（Illumina，San Diego，CA），平均覆盖率为×100。通过使用FastQC生成质量控制统计数据来执行序列读数的质量评估

（http://www.bioinformatics./projects/fastqc）。

Illumina CASAVA（1.8.2）用于解复用测序读数。使用Skewer（版本0.2.2）进行适配器修整。使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA-mem Version 0.7.2）将测序读数定位并与参考基因组序列（hg19）比对。使用samtools（版本0.1.18）丢弃整个读取和潜在PCR重复的Phred质量得分低于30的比对。为了提高灵敏度，使用samtools和varscan（版本2.3.5）执行变体调用。覆盖≤10X且不受至少4次读取（20％）支持的变体被丢弃。进行家族性变体分离以鉴定从头，常染色体隐性遗传和X连锁遗传。在对照数据库（dbSNP142,1000G，gnomAD）中，杂合体在杂合群体频率（GMAF）<>并且在健康个体（ExAC）中没有纯合子，并且根据它们在策划数据库中的存在或不存在而被分类为已知的或新的。使用标准预测工具（SIFT，Provean，Polyphen2，Mutationtaster，Human Splicing Finder v.3.0），跨物种的氨基酸保护评估（PhyloP，PhastCons）和美国医学遗传学院，根据它们破坏蛋白质功能的潜力对变异进行优先排序。和基因组学（ACMG）变异分类指南[6 ]。此外，我们应用了HOPE蛋白质预测程序（http://www.cmbi./hope/），该程序结合了包括蛋白质三维结构在内的结构信息（如果有的话），以分析蛋白质的特定突变效应。结构体。使用Integrative Genomics Viewer（http://software./software/igv/）在每个家庭中对视觉候选变体进行视觉重新分析。）并通过Sanger测序确认（引物序列可根据要求提供）。基因型 - 表型相关性被认为是鉴定候选变体和异常表型之间的因果关系的关键。现有信息来自医学文献和数据库（Pubmed，OMIM，ClinVar，Decipher）和胚胎发育中的相关蛋白质网络和信号传导途径（Reactome，Uniprot，Ingenuity途径分析（Qiagen））。我们系统地询问了斑马鱼，小鼠和果蝇表型数据库（www.zfin.org ; www.informatics.jax.org ; www.mousephenotype.org ; www.flybase.org）使用跨物种表型比较来验证候选基因。针对类似病例询问GeneMatcher（genematcher.org）。我们使用HGVS命名法版本15.11来描述变体效应（https://varnomen./）。将鉴定的所有变体提交至LOVD数据库

（https://databases./shared/individuals 00181103-09,00181141,00181143-49）。

功能研究

在3个胎儿中，来自受影响器官的FFPE组织用于针对年龄匹配的对照胎儿FFPE组织，用于候选基因的逆转录分析，以评估转录物的存在或不存在。对照组织来自胎儿，在胎儿宫内死亡可能由于窒息后通过尸检证实没有结构异常。用FFPE的RecoverAll TM总核酸分离试剂盒（Ambion，Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts）分离来自FFPE组织样品的RNA。用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）进行mRNA的逆转录（RT）。18S RNA引物作为质量控制。在2个胎儿中，使用额外的qPCR来确认转录物的较低浓度。用SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）进行qPCR。将转录物的表达水平标准化为GUSB表达。

结果

如果确定，表型和因果或候选变体总结在表  1中。补充表  S1显示了未解决的情况。不同器官系统中先天性异常的频率显示在补充表  S2中。我们确定了导致或可能解释19个家族中12个家庭中胎儿异常表型的变异（63％）。50％的家庭（6个家庭）获得了明确的诊断，而在其余6个家庭中，根据ACMG指南，变异必须被归类为未知显着的变异[ 6 ]。鉴定了12种不同基因的变体（RYR1，MKS1，FGFR2，PIGW，CENPF，KIF14，SMAD3，KIF4A，PTK7，DNHD1，TTC28和OTX2））。在8个不同的基因（RYR1，MKS1，FGFR2，PIGW，CENPF，KIF14，SMAD3和OTX2）中检测到被分类为影响或可能影响功能的变体。所鉴定的变体分为以下组：（1）先验诊断，因为它们在已知疾病基因中已知或新颖，解释胎儿异常表型，（2）通过鉴定其他家族证实与疾病相关和/或者因此导致描述新的疾病基因和相关表型，（3）可能通过临床和功能评价与（a）已知疾病基因或（b）新候选基因相关的疾病。

表1鉴定了胎儿表型和疾病相关和候选变体

疾病基因的已知或新颖变体解释胎儿异常

我们鉴定了影响或可能影响MKS1 ，OTX2，FGFR2和RYR1中蛋白质功能的变体。先前报道MKS1中的纯合变体影响剪接[ 7 ]，并解释了家族1中复发的Meckel-Gruber综合征样表型。据报道OTX2中的变异在极少数情况下引起agnathia-otocephaly [ 8]。]。虽然是新的，但是从头移位变异（c。[746delG]，p。（G249Vfs * 45））被认为影响功能，导致家族2中典型的agnathia-otocephaly表型。在双手并发的双手胎儿和脚和胼call体发育不全（家庭3），Apert综合征的分子诊断是通过鉴定FGFR2中已知的致病性从头变异[ 9 ]。对于家族4，我们先前证实骨骼兰尼碱受体1基因（RYR1）中的新型纯合剪接位点变体导致致死性水肿和严重的骨骼和平滑肌发育不全[ 10 ]。

新基因的变异被证实是新胎儿表型的原因

在家族5中，先前由Filges等人报道。[ 11 ]，CENPF中新的复合杂合截短变体在胎儿中被鉴定出来，建议临床诊断为Strømme综合征，同时患有严重畸形表型的兄弟姐妹使人联想到ciliopathy表型（c。[1744G> T]; [c.9280C] > T]，p。（E582 *）;（R3094））。在不相关的家庭中相同的基因变体和功能斑马鱼结果的识别证实因果关系和一个可变的表型呈现从可行Strømme综合征致死胎儿ciliopathy [ 11，12 ]。在KIF14中鉴定了新的复合杂合截短变体（c。[1750_1751delGA]; [1780A> T]，p。（E584Ifs * 16）;（R594 *））在两个胎儿中，睫状表型与家族6中任何描述的综合征不相容[ 13 ]。这是由KIF14中双等位截短变体引起的人类表型的第一份报告。作者建议KIF14是等位基因存活表型的候选基因，包括分离的小头畸形，现在已经在几个患有KIF14疾病相关变异的患者中得到证实[ 14 ]。

疑似变异 - 可能通过临床和功能评估与疾病相关

在6个家族中，在已知其他变异引起出生后表型的基因中鉴定出潜在的候选变体，然而，这种变异与胎儿中观察到的表型（SMAD3，KIF4A，PIGW）显着不同，或者目前尚不知道导致人类表型（TTC28，PTK7，DNHD1）。由于它们在动物模型中的不同途径和/或相似表型中的作用，它们被优先考虑。

其中新的候选变体可能导致胎儿表型不同于出生后表型的基因

在家庭7中，胎儿超声检查发现agnathia-otocephaly复合体，完全没有下颌骨，耳颌下颌位置，腭裂和主动脉峡部狭窄。无变体中鉴定OTX2和PRRX1通过ES和附加Sanger测序，其中致病变种被先前报道使agnathia-otocephaly表型[ 8，15 ]。新颖从头错义变异体SMAD3被优先化（C。[860G> A]，第（R287Q））出来的剩余四个候选者（KRT86，PRICKLE1，MYH3，SMAD3），因为SMAD3，OTX2和PRRX1报告于作用与鳃弓发育有关的相同信号通路[ 16]。先前报道SMAD3中的变体引起常染色体显性遗传的Loeys-Dietz综合征3（OMIM：613795），一种结缔组织疾病，表现为主动脉瘤，心脏异常，腭裂和显着的微/后悔。SMAD家族的蛋白质在转录调节中起重要作用。我们鉴定的变体位于SMAD3的MH2结构域中，对于不同SMAD蛋白（Uniprot）之间的相互作用是重要的。根据HOPE预测，突变残基可能干扰MH2结构域的结合特性，因为它不能形成氢键和盐桥。关于鸡胚的进一步功能研究正在进行中，以证明因果关系。

在根据预测算法鉴定的不同基因（OSGIN1，KIF4A，BCAT1）中可能引起疾病的3种变体中，我们认为KIF4A基因中的X连锁新型半合子错义变体（c。[2096T> A]，p。（V699E） ）可能与家族8的男性胎儿中的孤立性脑积水有关。该变体也存在于健康母亲中，与X连锁隐性遗传一致。据报道，KIF4A中的变异导致X连锁智力残疾（OMIM：300923）[ 17 ]。然而，KIF4A是一种运动蛋白，可在有丝分裂过程中将PRC1（一种胞质分裂蛋白）转运至纺锤体微管末端[ 18]]，调节PARP1在大脑发育和神经元存活中的活性[ 19 ]，并且是L1CAM循环途径的成员。众所周知，L1CAM中的变体可引起X连锁孤立性和综合征性脑积水[ 20 ]。该新变体位于高度保守的PRC1相互作用结构域中，预计会破坏相互作用。与年龄匹配的对照的FFPE脑组织相比，qPCR证实受影响的胎儿的脑组织中KIF4A mRNA 显着减少（12％）（补充图  S1）。低mRNA水平表明无义介导的衰变（NMD）和可能的功能丧失机制。

在家庭9中，两个胎儿都表现出Dandy-Walker畸形，肾积水，发育异常的肾脏和生殖器发育不全，以及一个胎儿的额外膈疝，这表明Fryns-或Fryns综合征的临床诊断。总共考虑6种基因的变体（ABCA1，AIM1L，CTDSP2，NOP16，RSU1和PIGW）。在两个胎儿中分离的PIGW（c。[106 A> G]; [106 A> G]，p。（R36G）中的纯合错义变体被优先排序，因为由PIG家族的PIGV和PIGN基因的变体引起的表型显示与Fryns综合征的表型重叠[ 21 ]或被描述为Fryns表型的因果关系[ 22]]。在GPI锚定生物合成的早期步骤中需要PIGW的存在，并且已经提出编码GPI锚定生物发生途径的组分的基因中的双等位基因变体是可变发育和畸形表型的罕见原因[ 23 ]。到目前为止，据报道，PIGW的变异导致糖基磷脂酰肌醇生物合成缺陷11（OMIM 610275），表现出发育迟缓，智力残疾和癫痫发作[ 24 ]。所描述的患者中的变体更接近基因的3'末端而不是具有我们鉴定的异常表型的胎儿中的变体。该变体位于跨膜结构域中，预测突变氨基酸会干扰蛋白质的转运活性（HOPE）。

新的候选基因

家族10的胎儿的结构异常，包括多个脑异常，脊柱裂，单侧眼球闭塞，胆管闭锁，Müllerian管的发育不全，肝肿大和双侧腭裂，对于任何先前描述的先天性异常综合征都不是特异性的。从具有潜在疾病相关双等位基因变体（MTHFD1L，PTK7）的两个基因中，我们在PTK7中选择了复合杂合错义变体（c。[19G> A]; [c.1238 A> G]，p。（G7R）; （N413S））作为自的功能小鼠模型2个PTK7损失的最佳候选显示严重神经管缺陷，囊性肾，小颌，与单方面无眼[ 25，26]。到目前为止尚未描述人类表型，但怀疑PTK7缺陷在神经管缺陷中发挥作用[ 27 ]，是胚胎Wnt和PCP信号通路中的关键蛋白。此外，PTK7调节Wolffian管道的生长[ 28 ]，这对于Müllerian管道的形成至关重要[ 29]]。检测到的变体之一（c.19G> A）位于转录物（NM_001270398.1）中，其编码蛋白质同种型e，其具有缺少用于在细胞膜中定位的信号肽序列的备选外显子1。目前，研究了该同种型的功能特性。对从受影响的胎儿的肝脏FFPE组织和年龄匹配的对照组织中提取的RNA进行的RT-PCR显示受影响的胎儿中的信号显着降低。相同样品的qPCR证实mRNA表达降低至6％（补充图  S2）。这些发现表明由于异常剪接导致的PTK7 mRNA 的NMD ，至少在肝脏和该同种型中。

在家庭11中，胎儿有复杂的心脏缺陷，左心发育不良，主动脉增生，二尖瓣闭锁，持续性静脉和房间隔缺损，融合肺叶，胆囊发育不全，肝内胆管减少，肠旋转不完全近端空肠的袋状延伸部分。畸形模式提示异型/纤毛病表型。ES检测到三种不同基因（CACNA1A，PLCH2，DNHD1）中潜在的疾病相关变异。DNHD1中的纯合错义变体（c。[6109 A> G]; [6109 A> G]，p。（S2037G））由于其在动力蛋白重链中的功能而被优先化，尽管没有报道血缘关系。其他基因的变异如已知DNAL1（OMIM：610062），DNAI1（OMIM：604366）和DNAH11（OMIM：603339），其编码动力蛋白区室，引起类似于反转的表型。关于DNHD1的确切功能知之甚少。据报道，它是智力残疾的候选基因[ 30 ]。家庭12出现肠闭锁复发。DNA只能从一个孩子那里获得三重分析。ES在4种不同基因（CASZ1，PLEKHM2，COL5A1和TTC28）中检测到复合杂合性，但仅在TTC28中检测到变异（c。[3638 A> G]; [c.794 A> C]，p。（D1213G）;（K265T））预测疾病相关并且在物种间高度保守。我们优先考虑TTC28，因为TTC7A（OMIM：609332）中的变体（同一基因家族的成员）导致常染色体隐性胃肠道缺陷，并且在人类纤毛病中报道了TTC21B（OMIM：612014）中的变体。

讨论

在我们高度选择的具有结构异常的胎儿系列中，解释胎儿表型的已知疾病基因中疾病相关变体的总体初级检出率为21％。对于这些家庭，可以提供有关预后和复发风险以及生育选择的信息，例如产前诊断或植入前遗传学诊断，可以进一步怀孕。其它研究报道的10-21％[检测率4，31，32，33 ]，但是，纳入标准和方法在所有研究中包括我们的是高度异质的，因此限制可比性。在确定新候选基因KIF14中变体的疾病关联后，我们的检出率增加和CENPF通过其他不相关的影响患者的调查，以及功能和动物模型研究[ 11，13]。鉴于agnathia-otocephaly和Meckel-Gruber综合征等临床诊断明显，Apert综合征的表现不典型，因为颅缝早闭症是相应的出生后表型的关键临床症状，在早期发育阶段无法被认识，因此阻碍了靶向分子遗传测试。这种反向表型强调了将胎儿表型作为发育时间变量的重要性。在另外6个家族中发现的候选变异不会立即产生临床影响，但可能会指导未来寻找进一步受影响的患者和进行确证证据的功能研究。特别是，PIGW变体之间可疑的因果关系对于Fryns综合征表型，KIF4A作为X连锁脑积水的L1CAM途径中的参与者和SMAD3中的变体由于Loeys-Dietz频谱的严重终结，除了正式的变异评估之外，还强调了临床和发育遗传学评估的重要性，这可能导致agnathia-otocephaly。类似地，所检查的约三分之一胎儿的表型，包括家族10,11和12，使人联想到某些类型的纤毛病，其与胚胎发育中的纤毛发生和纤毛功能中暗示的途径的基本作用相容。所鉴定的十二种病症中有九种可能在常染色体隐性遗传后发生，这可能部分反映了招募偏倚，包括表型复发的家族。然而，胚胎致死小鼠模型表明，常染色体隐性遗传可能在具有早期致死性的表型中起重要作用。鉴定KIF14导致致死性纤毛异常模式的变体突出了研究这种极端表型对于人类疾病基因的主要描述的重要性，代表了等位基因可存活的出生后疾病的严重表型谱。大规模项目，如国际小鼠表型分型联盟（IMPC）生产敲除小鼠品系将是支持新型人类疾病基因表征的重要资源。在我们无法描述一个引人注目的候选基因的七个家庭中的四个家庭中，胎儿出现了孤立异常的复发（补充表  S1））。这支持了对其他人的观察以及之前针对CNV的产前微阵列研究，即在存在多个异常时更可能发现单基因病因。除了胎儿表型分析和外显子组分析的多重限制外，多因素或多基因遗传或表观遗传机制仍然是一种可能的解释。需要更多的研究来探索全基因组测序在孤立异常中的效用，特别是当存在表型复发时，可能还暗示在产前期具有不完整表型呈现的隐性病症。尽管人们已经意识到调查这些家族的重要性，但是在产前领域中阐明候选变体的致病性是招募具有相同表型的其他无关胎儿是最重要的公认挑战之一。产前表型可能是不精确的，并且通常不会因各种原因进行尸检，从而损害表型 - 基因型比较和收集大量类似受影响的胎儿。潜在候选变异体的功能分析和适当的变体特异性动物模型的产生需要专业化和重要的资源。然而，当变体的解释继续仅依赖于出生后患者的经历时，产前ES的当前诊断产量可能仍然有限。在围产期招募患者可能会提高父母的期望，并且需要彻底讨论当前私人变体解释的限制。然而，使用ES作为整合精确胎儿表型描述的发现工具，我们有助于进一步了解胎儿生命特有的改变的发育途径。招募其他家庭和变异效应研究将是强制性的，以确认因果关系和了解疾病机制。除了在早期人类发育中获得关于生物机制的知识之外，这将允许从长远角度提高产前ES的效用，并且更多家庭将从这一敏感领域的诊断确定性中受益。并且需要彻底讨论当前私人变体解释的局限性。然而，使用ES作为整合精确胎儿表型描述的发现工具，我们有助于进一步了解胎儿生命特有的改变的发育途径。招募其他家庭和变异效应研究将是强制性的，以确认因果关系和了解疾病机制。除了在早期人类发育中获得关于生物机制的知识之外，这将允许从长远角度提高产前ES的效用，并且更多家庭将从这一敏感领域的诊断确定性中受益。并且需要彻底讨论当前私人变体解释的局限性。然而，使用ES作为整合精确胎儿表型描述的发现工具，我们有助于进一步了解胎儿生命特有的改变的发育途径。招募其他家庭和变异效应研究将是强制性的，以确认因果关系和了解疾病机制。除了在早期人类发育中获得关于生物机制的知识之外，这将允许从长远角度提高产前ES的效用，并且更多家庭将从这一敏感领域的诊断确定性中受益。使用ES作为整合精确胎儿表型描述的发现工具，我们有助于进一步了解胎儿生命特有的改变的发育途径。招募其他家庭和变异效应研究将是强制性的，以确认因果关系和了解疾病机制。除了在早期人类发育中获得关于生物机制的知识之外，这将允许从长远角度提高产前ES的效用，并且更多家庭将从这一敏感领域的诊断确定性中受益。使用ES作为整合精确胎儿表型描述的发现工具，我们有助于进一步了解胎儿生命特有的改变的发育途径。招募其他家庭和变异效应研究将是强制性的，以确认因果关系和了解疾病机制。除了在早期人类发育中获得关于生物机制的知识之外，这将允许从长远角度提高产前ES的效用，并且更多家庭将从这一敏感领域的诊断确定性中受益。

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