lncRNA研究思路分析及经典案例分享

近年来，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）相关研究的热度一直居高不下。非编码RNA是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子，其中常见的具有调控作用的非编码RNA包括长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、环形RNA（circular RNA，circRNA）等，这些RNA在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中都发挥重要的作用。

小编将在近期的微信中逐个对lncRNA、miRNA和circRNA做详细介绍，和童鞋们共同探讨ncRNA的研究思路。

今天我们先来梳理一下lncRNA的相关知识和研究思路，大家快点准备好板凳，我们准备开讲咯！

什么是lncRNA? lncRNA有几种类型？

lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，此后越来越多的研究表明，lncRNA在众多生命活动过程中发挥重要作用，并开始引起人们广泛的关注。再加上二代测序技术的发展，大量 lncRNA 被发现，lncRNA迅速成为当今生命科学最热门的研究领域之一。

根据染色体上与编码基因的相对位置将lncRNA分为以下几种类型：

• 反义型（antisense lncRNAs）

• 内含子型（intronic lncRNAs）

• 反向型（divergent lncRNAs）

• 基因间型（intergenic lncRNAs）

• 启动子上游型（promoter upstream lncRNAs）

• 启动子型（promoter-associated lncRNAs）

• 转录起始位点型（transcription start site-associated lncRNAs）

lncRNA的功能有哪些？

• 表观遗传修饰

  表观遗传学修饰是指在核内DNA序列不变的情况下基因表达的可逆和可遗传的变化， 这种修饰包括染色质重塑、DNA甲基化和组蛋白修饰。 

• 转录调控

  人类基因组中的启动子和增强子在转录中起着不可或缺的作用，包括控制基因表达的时间和程度，同时确定它们的活性。 因此，转录机制非常复杂。

• 转录后调控

  真核生物基因活性不仅可以通过转录方式进行调控，也可以通过RNA加工进行转录后调节，后一种调控机制是前体mRNA经历选择性剪接并作为竞争性内源RNA（ceRNA）。

• 其他机制

  除了上述功能以外，lncRNA还可以与其他lncRNA关联起作用，同时lncRNA中的功能基因多态性可能是与人类疾病有关的遗传修饰。

lncRNA的作用模式有哪些？

lncRNA 的作用模式主要分为四大类: signal、decoy、guide、scaffold。

• Signal archetype（信号原型）：作为转录活性的分子信号或指示剂；

• Decoy archetype（诱饵原型）：与其他调控RNA或蛋白结合并隔离；

• Guide archetype（指导原型）：指导核糖核蛋白复合物定位到特定目标；

• Scaffold archetype（支架原型）：作为相关分子元件（蛋白和/或RNA）组装的平台。

lncRNA常用数据库有哪些？

lncRNA数据库对于lncRNA的研究也很关键，为了便于大家快速查询lncRNA序列等相关信息，下面罗列一些常用的lncRNA数据库，供大家参考：

• ChIPBase：提供lncRNA的表达图谱和转录调控的全面鉴定和注释。网站：http://deepbase./chipbase/

• LNCipedia：对人类lncRNA的序列和结构全面的注释。网站：http://www.

• lncRNABase：提供miRNA调控lncRNA、假基因(pseudogene)和circRNA的互作信息和ceRNA调控网络。这些调控互作网络信息是基于高通量的CLIP-Seq实验数据。网站：http://starbase./mirLncRNA.php

• lncRNAdb：提供有生物学功能的lncRNA的全面注释。这是lncRNA研究领域的大牛John mattick实验室构建的网站。网站：http://www./

• LncRNADisease：提供了文献报道的疾病相关的lncRNA的注释。网站：http://cmbi./lncrnadisease

• NONCODE：提供对lncRNA的全面注释，数据库收录多达16个物种信息，网站：http://www.

  等等。

  
  

检测和验证lncRNA方法有哪些？

lncRNA的研究离不开对lncRNA的检测和验证，以下方法是使用较多的手段：

• 高通量测序、lncRNA微阵列分析：是检测lncRNA最常用的两种方法，它们都能同时检测到大量lncRNA的表达。

• qRT-PCR、Northern 印迹：可用于验证不同样品之间的差异基因表达。

• 荧光原位杂交、RNAscope： 可用于检测样品中lncRNA的位置，后者显示出更高的灵敏度和更高的特异性。

• RACE ：有助于获得全长lncRNA用于进一步研究。

• RNA pulldown，RNA免疫沉淀（RIP）、CHIRP，发现与lncRNA相关的蛋白。

鉴于lncRNA研究有多种方法，需要根据具体的实验情况选择合适的实验方法。

近几年有关lncRNA研究的国自然立项数和经费逐年增长，2016年261项，经费为1.08亿，2017年达到了345项，经费达到1.38亿，从国自然本身就可以看出lncRNA一直是当前生命科学领域研究的热点之一，同时针对lncRNA的研究也发表了大量的文献。lncRNA研究中经典的ABCD模式——A基因通过B基因/信号通路在C疾病中发挥D功能，供大家参考。

下图是常用的lncRNA研究思路：

案例分享：

接下来我们以中国医科大学薛一雪教授作为通讯作者发表在《Cancer Letters》（IF=6.375）的Long non-coding RNA H19 regulates glioma angiogenisis and the biological behavior of glioma-associated endothelial cells by inhibiting microRNA-29a为例，讲解一下lncRNA研究中典型的ABCD模式。

首先我们看一下这篇文章的题目：lncRNA-H19（A基因）通过抑制microRNA-29a（B基因）在胶质瘤相关内皮细胞（C疾病）中调节胶质瘤血管新生和生物学行为（D功能），完美符合ABCD模式。接下来开始分析这篇文章。

确定研究对象C疾病——胶质瘤

神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，并且具有侵袭血管形成的特征。通过放疗和化疗治疗的病人，其存活期仅12-14个月，治疗效果差的一个主要原因是肿瘤的血管新生比较突出，因此抗血管生成在神经胶质瘤治疗策略中将会越来越有前途。

确定研究A基因——lncRNA-H19

lncRNAs在神经胶质瘤的发生、发展中发挥重要的作用。之前的研究揭示了lncRNA-H19能调节肿瘤的癌变、血管新生和转移，且在很多人类癌症中表达失调。研究发现H19不仅在高级别胶质瘤中高表达，而且对于维持胶质母细胞瘤干细胞特性具有重要作用。

本文作者首先使用qRT-PCR方法检测了H19在胶质瘤微管和胶质瘤相关内皮细胞的表达水平，结果发现H19在胶质瘤微管和胶质瘤相关内皮细胞中表达水平都是上调的，如图1所示。

图1

随后作者在胶质瘤相关内皮细胞中做了H19的过表达和敲减实验，以评估胶质瘤相关内皮细胞的增殖、迁移和血管形成对血管新生的潜在作用，其中增殖、迁移分别使用CCK-8、transwell进行检测，实验结果表明过表达H19实验组的增殖、迁移和血管形成相比对照组都有一定提高，而敲减H19实验组的增殖、迁移和血管形成相比对照组都有所下降。说明H19的表达水平能够影响胶质瘤相关内皮细胞的表型。如图2所示。

图2

lncRNA-H19的分子机制——通过B基因发挥D功能

在了解了H19的功能后，作者随后进一步验证了H19的调节机制。之前的研究已明确lncRNA可以作为miRNA海绵来调节miRNA的表达及生物学功能，所以本篇文章也在验证H19是否通过这个机制来发挥作用的。作者用生物信息学数据库预测了H19的潜在作用位点。先用双荧光素酶报告基因检测验证了H19和miR-29a的相互作用，再用过表达或敲低H19对miR-29a表达水平的影响进行验证。结果发现，过表达H19能降低miR-29a表达，敲低H19能提高miR-29a表达，说明miR-29a是H19的一个作用位点。如图3所示。

图3

接下来作者验证了miR-29a对胶质瘤相关内皮细胞表型的影响。结果发现，过表达miR-29a会抑制胶质瘤相关内皮细胞的增殖、迁移和血管形成，而敲低miR-29a会抑制胶质瘤相关内皮细胞的增殖、迁移和血管形成。如图4所示。

图4

随后作者通过体外实验验证H19对胶质瘤相关内皮细胞的增殖、迁移和血管形成的影响是否与miR-29a有关。作者通过几组对比实验发现，H19（-） miR-29a（ ）组的细胞活力明显降低，而H19（ ） miR-29a（-）组的细胞活力明显提高。在H19（-） miR-29a（-）组中，miR-29a对细胞活力的的抑制作用弥补了H19敲低引起的抑制效果。同样，各组对迁移和血管形成的影响基本和对增殖的影响效果一致。如图5所示。

图5

作者确定了miR-29a和H19的相互作用后，还进一步研究了H19、miR-29a和其他基因是否在一个作用通路上。VASH2是已知的与肿瘤血管新生相关的重要基因，用Western blot实验检测了H19对VASH2表达效果的影响。结果发现，相对于对照组，VASH2蛋白表达在H19过表达组中是上调的，而在H19干扰组中是下调的。如图6所示。

图6

随后作者用双荧光素酶报告基因实验验证了VASH2是miR-29a的作用位点，同时为了确定VASH2是否受H19调节，作者检测了miR-29a过表达和敲低后对VASH2表达的影响。结果显示，miR-29a过表达后VASH2表达降低，miR-29a敲低后VASH2表达升高。如图7所示。

图7

之后作者通过实验进一步揭示了在胶质瘤相关内皮细胞中miR-29a参与调节H19对VASH2的表达效果以及VASH2参与了miR-29a对增殖、迁移和血管形成的调节过程，得出通路H19-miR-29a-VASH2可以调节胶质瘤相关内皮细胞的表型。如图8和图9所示。

图8

图9

最后作者通过实验分析了血管新生与H19和miR-29a表达水平之间的影响，发现H19敲低和miR-29a过表达都可以降低血红蛋白量，从而抑制血管新生。如图10所示。

图10

结论：

本文是第一次揭示了H19在肿瘤组织的微管和胶质瘤相关内皮细胞中高表达。体外敲低H19可以上调miR-29a的表达，从而抑制胶质瘤相关内皮细胞的增殖、迁移和血管形成。基于这些发现，H19/miR-29a可以被认为是未来神经胶质瘤治疗的潜在靶点。

本文小结：

lncRNA的表达或功能异常与人类疾病的发生密切相关，其中包括癌症、退行性神经疾病在内的多种严重危害人类健康的重大疾病，具体表现为lncRNA在序列和空间结构上的异常、表达水平的异常、与结合蛋白相互作用的异常等。因此，lncRNA研究对于生命科学领域至关重要，也将会作为遗传学研究热点持续下去。