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糖尿病患者皮肤因供血和神经营养不良易受到损伤，损伤后其愈合迟缓，极易形成慢性的溃疡性创面，内源性的病理异常与外在因素（感染、压力等）共同导致了糖尿病创面复杂的微环境。慢性难愈性创面所导致的截肢是糖尿病患者致残、致死的重要原因[1]。托里消毒散（组方为生黄芪、人参、当归、白术、金银花、连翘、茯苓、赤芍、白芷、皂角刺、桔梗、甘草）出自明代陈实功所著《外科对普通溃疡及糖尿病坏疽的治疗效果显著。 前期实验表明含有托里消毒散复方中黄芪、当归、白芷、皂角刺4味中药的精简方醇提取物具有良好的促糖尿病大鼠创面溃疡愈合的作用[4-5]，可以明显促进创面愈合早期血管的生成与愈合后期炎症反应的消散，但该方的主要药物成分和具体分子作用机制目前尚不明确。网络药理学建立在高通量组学数据分析、计算机虚拟计算及网络数据库检索的基础之上，结合了系统生物学、多向药理学等技术与内容，通过进行生物网络的构建与分析进而进行药物作用机制研究及新药的研发[6-7]，其所具有的整体性及系统性的特点与中药方剂多成分、多靶点、系统调控机体的作用特点相吻合，目前已被广泛应用于探索中药药效物质基础、药物作用机制及阐释配伍规律的相关研究中[8-10]。以往基于吸收、分布、代谢、排泄（ADME）过程的药动学过程联合网络药理学研究思路广泛用于中药药效物质基础与作用机制的研究中，但该方法的不足之处是基于化合物的二维结构来预测。如今根据化合物的三维（3D）结构及其在分子场中的相互作用来预测其理化性质及药动学的性质则是一种全新的方法[11]。在本研究中主要通过UPLC-Q-TOF/MS对托里消毒散精简方中黄芪、当归、白芷及皂角刺中的药物成分进行分析鉴定，并借助网络药理学研究方法探讨方中主要化学成分促糖尿病创面愈合的潜在靶标及可能作用机制，以期为托里消毒散精简方的物质基础研究奠定良好基础的同时为后续作用机制的验证实验提供科学的理论依据。 黄芪（批号141250581）、当归（批号151255164）、白芷（批号151253169）、皂角刺（批号151250673）4种中药饮片均由天津天士力制药集团股份有限公司提供，经天津中医药大学李天祥教授分别鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根、伞形科植物白芷Angelica dahurica (Fisch.exHoffm.) Benth. et Hook. f. 的干燥根、伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根及豆科植物皂荚Gleditsia sinensis Lam. 的干燥棘刺。乙腈（批号20161127，色谱纯，Fisher公司）；甲酸（批号20161025，色谱纯，Acros公司）；超纯水（Millipore公司）。 1.2 仪器 托里消毒散精简方成人剂量为生黄芪和当归各15 g/d，白芷和皂角刺各12 g/d，本研究将黄芪、当归、白芷、皂角刺按照5∶5∶4∶4的比例混合粉碎，加入70%乙醇回流提取2次，每次乙醇用量分别为10倍量、8倍量，每次提取1.5 h。药液滤过合并减压回收乙醇得到含黄芪和当归各0.267 g/mL，含白芷和皂角刺各0.214 g/mL的浸膏。实验时将浸膏配制成相当于原药材100 μg/mL的水溶液，经0.45 μm滤膜滤过备用。 2.2 提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析鉴定 2.2.1 液相色谱条件 采用Waters ACQUITY 2.2.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），质谱扫描模式采用正、负离子2种扫描模式，毛细管电压为0.8 kV，锥孔电压为20 V。离子源温度120 ℃，脱溶剂气体（氮气）温度为550 ℃，脱溶剂气流量为800 L/h，锥孔气流量为50 L/h。MSE扫描模式检测，质量扫描范围为m/z 50～1 200，碰撞气为氩气。用亮氨酸脑啡肽（m/z 556.267 7 [M＋H]+）作为内标进行质量实时校正，体积流量为0.5 μL/min，进样量10 μL。 本研究基于前期工作基础并结合相关文献报道[12-14]，以“diabetes”“wound healing”为检索词搜集与糖尿病创面愈合相关的靶点，通过PDB数据库（http://www./pdb/home.do）下载其蛋白结及ChemBioDraw软件搜集并绘制各药物成分的分子结构，以mol2格式的文件保存化合物的3D化学结构。因从PDB数据库中下载的蛋白结构往往会出现结构不完整、存在多聚体、缺少氢原子或含有多余的溶剂分子、水分子等情况，因此本研究采用Discovery Studio 4.5中clean protein模块补充蛋白中不完整的氨基酸残基、添加氢原子并纠正其可变构象。再次通过文献调研删除其他配体分子、水分子及其他溶剂分子，并对相应的氨基酸残基进行质子化处理。对于搜集得到的化合物分子添加CHARMm力场，simulation模块对其进行能量最小化处理。 2.4 分子对接 采用Discovery Studio 4.5中CDOCKER模块进行分子对接研究，输入蛋白名称并限定物种为人，利用高温动力学方法研究所搜集化合物与蛋白的相互作用。根据配体分子所在位置定义活性口袋。采用高温动力学搜索配体分子的柔性空间，利用模拟退火的方法将各个构象在受体活性位点进行优化。Pose cluster radius设为0.5，randomconformations设为10，在计算过程中考虑静电相互作用并利用格点技术计算非键作用。综合考虑计算得到的配体-受体相互作用结合能及配体分子与受体活性位点的相互作用情况得到可与靶标作用的化合物。 2.5 药物-成分-靶点-功能网络图的构建 Uniprot数据库（http://www./）对预测出可作用的蛋白查询其基因名称，利用KEGG及GO数据库对其功能进行注释，Cytoscape 3.0（http://www.）网络分析软件构建药物-成分-靶点-功能网络图。 通过UPLC-Q-TOF/MS对托里消毒散精简方的醇提物中黄芪、当归、白芷、皂角刺可能发挥药效的成分进行分析鉴定。结果表明，在正离子模式下共鉴定出26个化合物，对这些化合物进行分类整理发现这些化合物主要为黄酮、皂苷、香豆素、甾体和三萜类成分。负离子模式下鉴定出花椒毒素、东莨菪素（6-甲氧基-7-羟基香豆素）及zizyberanalic acid。正、负离子模式下均检测到了当归中的香豆素类成分花椒毒素，因此在正、负离子模式下检测并分析的化合物共28个，将所测成分的质谱图与质谱数据库和相关文献数据进行核对[15]并进行药物归属，成分鉴定结果见表1，正、负离子模式下的色谱图见图1。 3.2 托里消毒散精简方中药物成分与靶蛋白的分子对接 药物分子要与受体相结合进而发挥药效，两分子通过采取合适的取向使两者的必要部位相互契合，通过适当的构象进而得到稳定的药物分子与靶蛋白相结合的复合物，在这一过程中会产生特定的共价相互作用或非键相互作用，而以非键相互作用更为普遍。分子对接就是把配体分子放在受体活性位点的位置，然后按照几何互补、能量互补以及化学环境互补的原则来实时评价配体与受体相互作用的强弱，并找到两个分子之间最佳的结合模式。通过对结合自由能的计算可以得出配体与受体结合前后体系的非键相互作用能差。在本研究中药物分子与靶蛋白对接的自由能越小则表明药物分子与靶蛋白的相互作用越稳定。本研究通过质谱鉴定分析得到复方中共含有28个化合物，鉴于现有的资料11个化合物并未搜集到其3D化学结构，相关文献报道[16-17]对这些成分化学结构及药理作用的挖掘也较少，因此本研究仅对剩余的17个化合物进行分子对接，这些化合物主要包括皂苷、黄酮、香豆素、挥（NF-κB）、酪氨酸激酶（JAK1）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、IκB激酶β（IKKβ）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）、蛋白激酶B（Akt）、蛋白激酶C（PKC）这些靶点，而黄酮类成分则可作用于血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR2）、雌激素受体（ER）和PKC这些靶点。香豆素类作为白芷中的主要有效成分之一，紫花前胡苷、珊瑚菜素和氧化前胡素均可作用于ERK2、JAK、PI3K、MAPK、VEGFR2、Akt、ER和PKC，总体以紫花前胡苷的结合作用较稳定。皂角刺中含量相对较高的黄酮类成分黄颜木素可作用的靶点则非常多，几乎可作用于所有搜集到的相关靶点，而其萜类化合物白桦脂醇则可作用于MAPK，甾体类化合物β-谷甾醇则可作用于PI3K-γ、ERK2及PKC。当归中的挥发油成分藁本内酯虽可作用于ERK2、IKKβ、MAPK、PDK1、环氧合酶-2（COX-2）和PKC，但总体来说相比较其他化合物，藁本内酯与靶蛋白结合的稳定性稍差些。 所得结合能的结果可见黄芪皂苷IV与靶蛋白相互作用的稳定性较好。另据相关文献报道[18]黄芪皂苷IV可抑制糖尿病小鼠视网膜病变中NF-κB的磷酸化，通过与靶蛋白NF-κB的相互作用进而发挥抗炎作用，与上述分子对接所得结果相符，说明本部分研究具有一定的可信性，本研究以出示黄芪皂苷IV与NF-κB、Akt的3D结合模型为例，见图2。黄芪皂苷IV与NF-κB相互作用的分子对接示意图（图2-A）显示黄芪皂苷IV可分别与GLU60、ARG54、LYS218、LYS241形成氢键；黄芪皂苷IV与Akt相互作用的分子对接示意图（图2-B）显示黄芪皂苷IV可分别与GLU234、ASP292、TYR437、ASP439形成氢键。 对预测出可作用的蛋白，利用Uniprot数据库查询其基因名称，KEGG及GO数据库对其功能进行注释，具体靶蛋白及其功能见表3。利用Cytoscape 2.6.0软件将托里消毒散精简方中所含有化合物的潜在作用靶点及其功能进行整合，构建药物分子-靶点-功能网络（图3）。网络图中的节点分别代表药物分子和靶蛋白，边代表特定分子与蛋白质之间存在的相互作用，成分-靶点关系共计210对。该网络图表明托里消毒散精简方中所含有的皂苷、黄酮、香豆素、甾体类和三萜类成分可通过调节相关靶蛋白而发挥抗菌，抗炎，免疫调节，促细胞分化、迁移及成管等作用。4味中药中即存在一个药物分子与多个靶蛋白相结合，同时也存在不同的药物分子共同作用于同一个靶蛋白继而发挥协同作用，引发不同的生物学效应。这一结果表明了托里消毒散精简方所具有的多成分-多靶点-多效应的作用特点，符合传统中药复方多成分、多靶点、多途径相互作用的特点。 皮肤创面的愈合是一个高度有序而又复杂精细的动态过程，正常的伤口愈合由凝血期、炎症期、增殖期和重塑期所组成，4个阶段连续发生相互交错[19]。糖尿病所伴发的一系列血管及神经并发症使得糖尿病患者的皮肤更易受到损伤且其伤口愈合延迟。异常的炎症反应[20]、血管生成受损及基质沉积的减少是糖尿病性创面的主要病理性特征。托里消毒散精简方含有的黄芪、当归、白芷、皂角刺可以流通气血、托毒外出防止毒邪内陷。现代药理学研究表明黄芪主要含有黄芪多糖、黄芪皂苷及黄芪黄酮等成分，黄芪多糖广泛参与机体免疫的调节，而黄芪皂苷及黄酮类成分则具有血管活性调节的作用[21]。当归含有挥发油、有机酸及多糖类等成分，同样具有血管活性的调节作用。研究表明当归水提物可以促进斑马鱼体内的血管新生及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）体外的血管生成[22]。白芷含有丰富的香豆素类化合物，具有良好的抗炎活性。但另有对托里消毒散精简方中的成分进行分析发现复方中含有皂苷、黄酮和香豆素类等成分，因此推测这些成分可能是托里消毒散促糖尿病创面愈合的主要有效物质基础。 炎症反应在创面的愈合过程中发挥着重要的作用，早期高效的炎症反应不但可以清除创面的异物与细菌，还有利于向增殖期过渡，若创面的修复一直停滞在炎症期则发展为慢性创面，而炎性细胞的消散延迟还会产生各种蛋白酶，降解细胞外基质从而不利于胶原的沉积[25]，影响了创面的闭合收缩。NF-κB及其下游信号通路的激活在糖尿病中发挥了重要的作用。NF-κB是一种主要由p50和p65亚基组成的异二聚体蛋白，正常情况下NF-κB与细胞质中的抑制性因子IKB相结合以无活性的状态存在，其上游IKK可与IKB亚型相结合引起IKB的磷酸化并对其进行降解，当IKB从无活性的细胞质复合物解离时会导致其活性亚基NF-κB p65蛋白向细胞核进行转位，与DNA位点相结合并触发下游相关基因的表达[26]。相关研究[27]表明高糖可以刺激核转录因子NF-κB的活化，导致大量白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-8等相关炎症因子的释放。本研究利用分子对接及网络药理学方法探讨托里消毒散精简方中的药物成分促糖尿病创面愈合可能作用的靶点并构建药物分子-靶蛋白-功能网络，发现方中黄芪、皂角刺和白芷中所含有的皂苷、黄酮及香豆素类成分均可作用于IKKβ和NF-κB，而当归中的藁本内酯也可作用于IKKβ，提示这些成分可能通过NF-κB信号通路协同发挥抗炎作用，抑制创面的炎症反应，改善创面局部微环境，为糖尿病创面的完整修复提供良好的条件。 增殖期肉芽组织的填充是创面愈合的重要步骤，新生血管的生成不但可以改善创面的微循环，而且可以为组织提供丰富的氧气和营养物质，促进创面的血管化已然成为了促糖尿病创面愈合的另一重要手段。创面的血管生成需要内皮细胞的活化、增殖、迁移并形成管状结构，多种生长因子及多条信号通路共同参与了这一过程的调节。糖尿病创面中堆积的糖基化终末产物（AGEs）可通过降低一氧化氮合酶（NOS）的活性减少NO的产生，导致内皮细胞的功能障碍，创面血管生成减少；AGEs还可以导致创面中生长因子的减少和其活性下降从而不利于创面中主要的修复细胞发生活化、迁移等作用。促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）在介导从细胞表面到细胞核中的生长因子受体的细胞内信号中处于核心地位，MAPK家族主要包括细胞外调节激酶（ERK）1/2、JNK和p38 MAPK，其中ERK1/2在介导众多细胞的分化、增殖及迁移过程中起到了重要的作用[28]。血管内皮生长因子（VEGF）作为最强大的生长因子，是血管生成过程中最重要的内皮细胞促有丝分裂原。VEGF与其受体VEGFR2相结合可以促进内皮细胞的增殖、迁移及血管的生成，激活细胞内酪氨酸激酶并触发多条促进血管生成的下游信号如PI3K/Akt和eNOS等[29]。活化后的PI3K可通过磷酸化Akt的Ser473和Thr308位点激活Akt，Akt进一步磷酸化eNOS的Ser1177位点激活eNOS从而诱导细胞内NO的生成。NO作为刺激血管生成强有力的介质，其可以增加血管通透性，促进血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成等。因此通过对糖尿病创面中ERK1/2、PI3K/Akt等众多信号通路的调节将利于修复细胞向创面中增殖、迁移。在本研究中托里消毒散精简方中黄芪、皂角刺和白芷所含有的黄酮和香豆素类成分均可作用于靶蛋白VEGFR2，香豆素、皂苷和黄酮类化合物还可作用于PI3K及Akt，而香豆素和黄酮类化合物又可结合eNOS，提示托里消毒散可能通过VEGF及PI3K/Akt/eNOS信号通路促进内皮细胞的迁移和成管进而促进创面的血管化。 糖尿病难愈性创面在中医属于“疮疡”范畴，“补里透托”即通过补益气血和透脓的药物，以扶助正气、托毒外出，为中医外科疮疡疾病中最具有特色的内治方法之一。本研究表明托里消毒散精简方中所含有的黄酮、皂苷和香豆素、甾体类及萜类成分可能为该方发挥糖尿病创面愈合作用的主要药效物质基础，进一步分析药物成分-靶蛋白-功能网络发现这些成分可能通过调节相关的靶蛋白进而调节相关信号通路发挥不同的生物学效应。方中皂苷、黄酮及香豆素类成分既可通过调节NF-κB信号通路发挥抗炎的作用，又可以通过VEGF和PI3K/AKt/eNOS信号通路促进创面的血管新生，透脓而载毒外泄，改善创面微环境的同时促进创面的血管化，“托”与“透”相结合以利于糖尿病创面的愈合。据相关文献报道黄芪中的主要皂苷类成分黄芪甲苷Ⅳ可以抑制LPS刺激下单核细胞与巨噬细胞向内皮细胞的黏附作用，抑制LPS或TNF-α诱导条件下NF-κB的活性[30]。黄芪甲苷IV还可以通过ERK1/2通路促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖和体外血管生成[31-32]。黄芪中的黄酮类成分毛蕊异黄酮，可以促进斑马鱼模型体内的血管新生和HUVECs的体外血管生成[33]，其促血管生成的作用可能与作用于雌激素受体ER和MAPK信号通路有关。本研究通过网络药理学研究方法初步显示托里消毒散精简方中的药物成分能够调节相关靶蛋白进而调节相关信号通路从而共同产生抗菌、抗炎、免疫调节及促血管新生等生物学效应，为后续作用机制的实验验证提供了一定的参考方向。 参考文献（略） 来 源：李依洋，杨 珍，张晓娜，翟仰魁，孙 蓓，潘从清. 基于分子对接及网络药理学的托里消毒散精简方促糖尿病创面愈合作用机制研究 [J]. 中草药, 2018, 49(14):3298-3308. |
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