|
摘要：代谢工程可以使微生物菌株有效地生产化学物质和材料，但它需要大量的时间、努力和成本，使菌株在工业上具有竞争力。系统代谢工程是将系统生物学、合成生物学和进化工程的工具和策略与传统代谢工程相结合，近年来被用于促进高性能菌株的开发。在过去十年中，这一跨学科战略不断得到改进，以发展具有工业竞争力的生产过剩菌株。在这篇文章中，综述了系统代谢工程的最新趋势，包括工具和策略，这里重点介绍了宿主菌株选择、代谢途径重建、耐受增强和代谢通量优化等方面的最新进展，并对未来的挑战和前景进行了展望。 原文：Choi K R， Jang W D， Yang D， et al. Systems Metabolic Engineering Strategies: Integrating Systems and Synthetic Biology with Metabolic Engineering[J]. Trends in Biotechnology， 2019. 图片由maple绘制 系统代谢工程的出现 自1991年以来，代谢工程开发微生物菌株从可再生原料中生产数百种不同化学品的能力。然而，真正达到工业规模生产的生物制品的数量很少，这主要是由于包括原材料、生产(发酵)和回收/纯化成本在内的总体生产成本较高。尽管在代谢工程领域已经取得了巨大的进步，但要使生物工艺与相应的石化工艺相竞争，仍然需要提高菌株的性能。此外，在初始阶段的代谢工程项目往往没有考虑工业化生产中出现的实际问题。此外，反复试错式的开发周期来提高性能，其结果是不完整的理解宿主生物体的遗传和代谢机制在实验室和实际生产规模，以及进一步增加人力和投资(数亿美元)要求开发株。 系统代谢工程是将系统生物学、合成生物学、进化工程与传统代谢工程相结合的产物，它的出现加速了具有工业竞争力菌株的发展。系统代谢工程在设计一个新项目时，还考虑了上游(菌株开发)过程中的中游(发酵)和下游(回收和纯化)过程，促进了项目目标生物制品的规模化生产。 近年来在组学、基因组尺度代谢模拟、基因工程和进化工程等领域的研究进展，拓展了系统代谢工程的工具和策略，使菌株的大规模、并行和系统工程越来越多地实现其优异的性能。以往关于系统代谢工程的综述主要集中在描述系统代谢工程策略，以通过几个具体的例子来发展过产菌株，或者总结系统生物学、合成生物学和进化工程学的工具和策略，这些工具和策略对进行系统代谢工程研究非常有用。本文结合系统代谢工程的最新发展趋势，结合在系统代谢工程研究的各个关键步骤中有用的工具和策略，介绍了新的工具和策略，有望进一步扩展系统代谢工程的力量。此外，还讨论了当前的局限性和对未来发展的建议。 关键图 项目设计 应市场及社会的需求，从大宗化学品到特殊化学品的生物基生产备受关注(图1A)。生物基生产大宗化学品——从生物燃料和溶剂、有机酸、聚合物和单体、食品和动物饲料添加剂——低价大量消耗，关键是实现高效价(> 100 g / L，甚至最好> 200 g / L)产品的高产量。效价(产品浓度)、收率和生产率是评价生物工艺竞争力的重要性能指标。效价是发酵结束时产物的最终浓度，而产率是每消耗一克(或摩尔)底物(通常是碳底物)生成的产物的克(或摩尔)。生产力可以定义为特定的生产力或容量生产力。单位时间内每单元生产的产品数量(克或摩尔)为单位生产率，容积生产率为单位时间内每容积生产的产品数量(克或摩尔)。获得所有这些性能指标的高值是很重要的。例如，高效价通常有助于降低成本和简化分离和纯化过程中的技术困难。在生产大宗化学品时，由于碳源是整个生产成本的主要来源，因此获得高产就显得尤为重要。生产率与生物工艺的整体运行成本密切相关，因为它决定了整个生物工艺中发酵罐和其他操作单元的大小，进而影响到年度设备折旧成本和初始直接固定资本成本。此外，消除副产物的形成，对于降低回收和纯化成本，同时进一步提高产品收率也很重要。 随着消费者越来越多地提倡使用环保产品，而世界各国政府正倾向于生物基产品的规定(例如，禁止一次性使用石油生产的塑料)，如果生物基化学品和材料具有相同或类似的性质，即使生产成本稍微高一点，也会越来越多地采用它们。显然，高价值产品包括具有特殊性能和功能的生物基聚合物。其中，聚乳酸羟基乙酸共聚物和细菌纤维素、药物、中性保健品、香精香料、功能蛋白等特种化学品和材料具有更高的市场潜力，更容易进入市场。这些高价值的产品是当代代谢工程师的诱人目标。虽然这类生物制品目前的生产效价没有生物基大宗化学品的生产效价高，但由于自然资源的缺乏、对目前生产的伦理/政治关切或化学合成方法的缺乏/效率低下而造成的高价格有助于提高其生物基生产的竞争力。 除了生产药品和保健品，工程微生物本身也可以作为活体疗法。随着最近认识到微生物组对人体健康的深远影响，工程共生体正受到关注，以达到预期的健康效果。代谢工程应用于肠道感染预防、活体诊断、活体治疗、药物递送和实时诊断。 环境污染物的降解是系统代谢工程的另一个重要目标(图1A)。一些菌株被设计成能够有效降解目标化合物，但其他菌株也能够通过消耗污染物产生有价值的化合物。这一令人着迷的研究分支有望解毒的环境污染物，如微/纳米塑料和溢出的石油。 大部分的代谢工程项目都集中在“从头开始”(即(从可再生碳源，通常是从葡萄糖中)目标生物制品的生物合成。然而，当上游生物合成途径(即，从可再生碳源到生物合成途径中间的某些点)不完整或效率低下，而前体价格低廉(图1A)。此外，将传统的生物生产策略与多用途、高效(更理想的是环保)的化学转化策略相结合，使得生物基产品的组合更加多样化(图1A)。 可再生碳资源的选择也在扩大。尽管以水解淀粉和原糖形式存在的葡萄糖和蔗糖等典型糖的使用在生产目标化学品中最为常见，但近几十年来，木质纤维素的使用也得到了积极的研究(图1A)。C1化学品是最近出现的碳源(图1A)。虽然目前通过C1碳同化/利用的生物产品生成不如常规碳源高效，但甲烷、甲醇、甲酸和二氧化碳的使用呈上升趋势。设计系统代谢工程项目的战略将继续发展，以适应世界上迅速变化的社会、经济和政治局势。 宿主选择 模式微生物如大肠杆菌和酿酒酵母仍然是最广泛用于生产各种生物制品的宿主，这是由于对其代谢和生理的了解最为充分，相应的工程工具也得到了很好的发展。然而，一些化学物质可以更有效地由天然过表达菌株生产，如梭状芽胞杆菌生产丙酮和丁醇等，棒状杆菌生产氨基酸，Mannheimia succiniciproducens生产琥珀酸，红球菌属和Yarrowia lipolytica生产脂质、脂肪酸和衍生品，放线菌生产多酮类化合物和抗生素 (图1B)。因此，可以调控这些微生物的代谢途径，使其产生的化学物质与其天然产生的代谢产物共享相同的生物合成途径。针对这些重要平台菌株的高效工程工具正在不断升级，以促进代谢工程。 为了回应公众对使用可能不安全的微生物来生产人类食用或使用的化学品和材料的担忧，通常认为安全的生物体(GRAS)正日益被认为是生产供人类直接使用的生物制品的宿主菌株。除了详细研究的GRAS菌株(如S. cerevisiae、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum)，乳酸菌、Pseudomonas putidaKT2440等未被探索的GRAS菌株作为潜在宿主菌株受到关注。此外，蓝细菌、微藻和甲基营养菌作为以C1化学物质为原料的工程宿主越来越受到关注。嗜热细菌也被认为是代谢工程的宿主，因为它们的高温发酵过程可以降低微生物和噬菌体污染的风险，并且与各种现有的工业化学过程更加兼容。类似地，嗜盐菌以海水为基础的露天发酵，最大限度地减少污染，同时节省淡水用于其他用途。 随着生物工程能力的提高，工程宿主不再局限于微生物，而是扩展到高等真核生物，包括植物细胞和哺乳动物细胞，甚至包括完整的活的多细胞生物，如活的昆虫和植物。对具有生物基生产某些产品的诱人优势的各种生物的进一步探索可能会越来越多。 代谢途径重构 与传统的侧重于优化内源性途径或重建异种但天然的途径以产生标准代谢物不同，近年来合成生物学和计算生物学的进展使得为所需的化学物质设计新的和特定的代谢途径成为可能。除了利用KEGG、MetaCyc、BRENDA等代谢反应/通路数据库中已知的代谢反应组合重建外源代谢通路的典型策略外，还包括利用酶反应中根据底物和产物的化学结构生成的反应规则，可以简化设计过程(图1C)。利用酶的底物混杂性进一步加速设计通向目标化合物的新颖高效的生物合成途径。此外，酶的定向进化和从头设计有助于扩大可以生物生产的天然和非天然化学物质的光谱(图1C)。 在激活沉默的生物合成基因和簇的同时，利用筛选工具X-ome发现催化新反应的新酶的工作一直在进行(图1C)。化学方法与生物合成方法的结合也进一步拓宽了可生产化学品的框架。人工智能预计将在预测生产所需化学品和材料的可行化学合成路线方面发挥越来越重要的作用。 基因工程工具和策略的进步加快了将设计的代谢途径成功引入实际生产菌株的步伐。新颖高效的DNA拼接工具，如BioBrick assembly、Gibson assembly、Golden Gate assembly、ligase cycle reaction、single-strand assembly、transform-associated recombination (TAR)克隆、uracil specific cut reagent (USER)克隆等。促进了多组分的组装和大型基因集群和代谢途径基因的表达 (图1 c)。此外，寡核苷酸和基因合成技术的进步，降低合成成本已经使它更可行的优化构建代谢途径基因表达在每个主机的压力(例如，并检测许多组合重组的基因簇和表达模块。事实上，这些新技术正在加速系统代谢工程研究的设计-建造-测试周期。 尽管基于质粒的代谢途径基因簇的重建和表达十分方便，但对质粒不稳定性和拷贝数波动的担忧在工业环境中并不可取，因此一直敦促研究人员开发稳定染色体整合的方法(图1C)。传统的同源重组系统使用计数选择标记(如pyrF、sacB和upp基因)将感兴趣的基因导入目标基因组位点往往耗时费力，因此常使用位点特异性重组系统和基于转座的随机插入系统来促进这些过程。然而，与同源重组系统相比，由于位点特异性重组酶和转座子的内在特性，基因整合位点的选择受到限制（分别过于特定和过于随机)。最近，重组技术在供体质粒系统的帮助下扩大了整合大小限制，同时克服了上述位点特异性重组和转座子基础系统的局限性。CRISPR/Cas诱导的双/单链断裂以及随后的同源重组或再结合也常用于基因的染色体整合。 上述工具和策略促进了长而复杂的生物合成途径的重组，用于复杂化学品的异种生产，特别是天然产物的异源生产。例如，将植物、哺乳动物、酵母和细菌的21和23个酶促反应的完整阿片类物质生物合成途径整合到酿酒酵母的染色体中，成功地合成了阿片类物质thebaine和hydrocodone。在另一项研究中，阿片类生物合成途径被分配给不同的大肠杆菌菌株，这些菌株的逐步发酵，从简单的碳源生产阿片类物质。同样，将抗肿瘤药物紫杉醇的前体氧合紫杉醇的生物合成途径分配到大肠杆菌和酿酒葡萄球菌中，并在随后的两种微生物的共培养中证明可产生氧合紫杉醇。使用这种“分而治之”的方法开发的混合工程菌株进行生物处理，是否真的可以用于大规模工业化发酵生产复杂分子，这将是一个有趣的问题。 图1 增加宿主对目标化学物质的耐受性 如果了解毒性的分子机制，宿主菌株对目标化学物质的耐受性可以得到合理的提高。例如，减少有毒化学物质进入细胞，防止有毒物质转化和进入细胞的生物量，以及积极向细胞外空间输出有毒化合物，成功地增强了对有毒化学物质的耐受性(图1D)。 如果毒性机制尚未报道，适应性实验室进化(adaptive laboratory evolution，ALE)是分离对目标化合物具有耐药性的菌株的有效策略(图1D)。随后对分离菌株的系统分析可能揭示其耐药的分子机制，并对宿主菌株进行进一步的合理工程处理，可进一步的耐受增强(图1D)。最近发明的工具和连续培养和后续的筛选策略——例如，PACE、YOGE、ICE和MAGE。基于使用的选择策略，ALE方法还将有助于鉴定在效价和生产力方面具有更好性能的菌株。 目标化学品的毒性问题也可以通过工艺工程策略来规避。对具有毒性作用的化学物质进行原位回收，并在发酵过程中将毒性产物或前体隔离到另一阶段，已被证明可以降低毒性，提高菌株的性能(图1D)。这种工艺可能在下游工艺中提供产品回收和净化的进一步优势。 代谢通量优化 通过重建的生物合成途径，构建能够产生理想产物的基础菌株，可以利用各种工具和策略，最大限度地提高向目标产物的代谢通量。宿主代谢网络的系统分析和其他组学数据在这方面发挥了关键作用，例如最初的系统代谢工程研究显著提高了L-缬氨酸和L-苏氨酸的产生。近年来DNA/RNA测序、质谱等组学策略的技术突破，使得获取更多与细胞生理代谢相关的数据(生物大数据)成为优化生产菌株的线索(图1E)。 转录组分析揭示特定条件下激活的代谢过程来设计和优化菌株和过程。然而，应仔细检查转录组数据以了解代谢，因为代谢活动与转录水平没有直接关系。蛋白组分析比转录组分析更能反映实际代谢活动，近年来质谱分析的发展促进了蛋白质组分析的发展，对细胞生理学的认识也更加全面。蛋白质组学的最新进展也使人们了解翻译后修饰对代谢工程的影响。对蛋白质-蛋白质相互作用的进一步考虑有望为系统代谢工程提供更深入的见解。但是，应该指出的是，蛋白质(特别是酶)的水平也不一定与其酶的活性相匹配。代谢组学直接观察特定条件下代谢产物的水平，可以补充我们的理解，因此也被用于优化菌株的性能。然而，低浓度代谢物的定量仍然是一个挑战。在所有的组学研究中，代谢物定量组学分析是对细胞代谢最接近的描述，被广泛应用于各种化学物质的工业菌株的开发。尽管在准确确定通量值方面还存在技术困难，但定量分析有望为系统代谢工程提供蓝图。随着组学工具和策略的发展，各种计算基因组规模代谢模型(GEMs)和相关模拟方法已成功应用于开发多种过产菌株(图1E )。将转录组、蛋白组、通量组等组学数据整合到GEMs中，获得更全面的细胞代谢视角是该领域的最新趋势。代谢与表达(Metabolism and expression，ME)模型就是一个例子，它将定量蛋白组学数据中提取的基因表达和蛋白合成信息整合到GEMs中。类似地，另一种称为GECKO的建模方法通过结合酶的动力学参数提供了一种计算细胞条件的方法。 与组学和计算机建模/模拟的进展相平行，合成生物学工具和策略的快速进展进一步加快了过产菌株的构建。尽管包括重组系统在内的传统但高效的基因组工程工具在工程中得到了积极的应用，但CRISPR/Cas技术最近的出现改变了工程范式(图1E)。为了精确控制靶基因的表达，平衡向靶产物的代谢通量，已经生成了启动子和核糖体结合位点(RBS)文库，寻找靶基因的最优表达水平，最大限度地形成所需的产物(图1E)。此外，我们还利用必要基因的结合，对质粒拷贝数进行可调和稳定的控制，设计了转录激活子样效应子(TALE)偶联启动子，固定表达水平，不依赖于基因拷贝数(图1E)。 反式作用基因表达的工具，包括合成小调控RNA(sRNA)，RNAi，和CRISPR干扰(CRISPRi)，使基因表达的快速系统筛选修改目标(图1)。表达下调的翻译选定目标mRNA在细菌中通过使用合成sRNA菌株制造出过量的化学物质可以很容易地和有效地开发了。对于真核生物来说，RNAi已经成功地通过翻译抑制或转录本降解来降低靶基因表达，从而提高靶化学产物。相反，CRISPRi可以阻断靶基因的转录，也可以高效筛选有益的基因敲除靶基因，进而增强靶化学物质的产生。进一步开发反义RNA和CRISPR/Cas系统还可以实现靶基因的去表达、过表达和甲基化系统(图1E)。配体是一种顺式作用的基因调控元件，可在特定配体结合时改变其二级/三级结构，引入到靶基因的5’端，是根据特定配体浓度对靶基因表达水平进行微调的另一种策略。这些基因表达调控工具可以与代谢物生物传感器结合，通过高通量筛选识别工程目标(图1E)。代谢物生物传感器产品组合的进一步扩展有望促进对有益工程目标的高通量筛选，从而开发出适用于工业化生产的生物基化学品的高性能菌株。 除了基因工程策略，底物通道是另一种策略来增强代谢通量(图1)。除了空间上相关酶使用合成支架或直接融合模块，目标酶可以隔离，与细菌细胞中合成微室或在真核细胞中特定细胞器。这些策略可以保护中间体不受竞争途径的干扰，分离有毒中间体，并增加中间体和酶的局部浓度。 扩大到工业生产 当发酵规模扩大到试点规模，并最终达到工业化生产的商业化水平时，在实验室规模下表现良好的过产菌株可能表现不佳(图1F)。例如，不同发酵规模下的氧传递谱的变化对好氧发酵菌株的性能至关重要。此外，随着发酵剂尺寸的增大，由于混合不完全，导致局部底物浓度差异的机会增大，从而导致性能不理想。在系统代谢工程研究的项目设计步骤中，可以对扩增过程中的许多典型问题进行预测和考虑，从而产生能够抵抗发酵条件变化的菌株(图1)。此外，系统代谢工程有助于解决意想不到的问题出现在扩大重新应变工程周期提高在大规模发酵菌株的性能(图1)。此外，基于质粒的基因过表达往往具有质粒不稳定的风险，尤其是在代谢负担存在的情况下。这种含有质粒的生产菌株的遗传不稳定性问题可以通过整合染色体来克服，如前所述。虽然不提倡使用抗生素，但影响发酵行业的微生物污染问题是一个需要高度重视的严重问题。最近的研究表明，通过向生产宿主引入外来生物养分利用途径，生产宿主的竞争适应度得到了提高，从而避免了污染生物体。使用常见的化合物作为宿主的氮源也很容易被污染生物体所利用，不如使用只有含有利用途径的生产宿主分解的稀有的外来生物营养化合物(如三聚氰胺)作为氮源。这种创新策略可以解决在没有抗生素的情况下生长的微生物受到污染的问题。 工程菌的生物防护是开发工程工业生产菌株需要考虑的另一个重要问题——不仅要防止有害的环境传播，而且要确保菌株的安全。虽然大多数这样的生物抑制系统探索的是需要外源性或非天然代谢物才能生长的营养缺陷菌株，但合成生物学的最新进展构建了合成生物回路，只有在满足复杂的营养组合时才允许细胞生长。这些工具和战略被认为将进一步扩大目前已成功应用于该行业的突出生产过剩菌株和生物工艺的情况。 图2 结束语和未来展望 十多年来，系统代谢工程证明了其简化从最初的菌株设计到大规模工业化生产的整个过程的潜力。这个跨学科领域持续快速发展与进步领域的系统生物学，合成生物学，进化工程。不断开发新的工具和策略加速优越的生产菌株优化设计和工程实际的工业应用。如前所述，只有少数已开发的生产者菌株和工艺实际转化为工业生产。尽管系统代谢工程已经成功地开发出了许多能够产生多种化学物质和物质的微生物菌株，但还有一些更重要的化学物质，特别是具有高度医学和营养意义的天然产品，有待生产。由于缺乏对相应的生物合成途径/酶以及通常涉及一些难以表达的植物或动物起源基因的长/复杂的生物合成途径的完整知识，开发用于生产许多此类天然产物的工程菌株仍然困难。持续的基因组挖掘和酶工程/进化将扩大有效的生物合成途径和酶的库(图2)，同时还需要开发更好的工具来表达迄今为止难以表达的基因。 精确的解决方案由计算机代谢模拟也迫切需要，使得达到可预测性(图2)。转录组学数据的整合、翻译和代谢酶的催化率以及相关蛋白质组、代谢物、流量组和调控组信息预计将提高建模与仿真的精度。更好地理解和发展计算机模拟结果与应变发展中的实际组分和参数(如启动子/RBS及其强度)之间的定量联系，将进一步促进建模和模拟结果在应变实际构建中的应用(图2)。 用于菌株发育的生物元件在不同的生物环境中往往表现出显著的波动和相互干扰。菌株/生物部件的标准化和模块化，或者预测不可避免的干扰并为工程提供正确设计的计算机工具的发展，将使不必要的试错式实验最小化(图2)。预计数据量仍将迅速增加。随着生物大数据的出现，数据科学和人工智能的工具和策略将越来越多地用于提取新的知识和信息，以及提出更好的工程策略来升级系统代谢工程(图2)。 |
|
|
