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作者：何奕霖，南京农业大学硕士在读，主要研究噬菌体与根际健康。 周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍大肠杆菌中噬菌体抗性格局的高通量映射，原文于2020年发表在《Plos biology》上。
噬菌体是微生物群落动态和功能的关键参与者，并且能够驱动全球生物地球化学循环和人类健康等多个过程。噬菌体往往以捕食者的身份攻击特定的宿主，而这些宿主反过来通过一系列机制来保护自己。然而到现在为止，尚不能快速全面地识别噬菌体侵染和抗性中的细菌宿主因子。本研究中，作者利用两株已知序列不同的模式大肠杆菌菌株(K-12和BL21)，绘制了参与14种系统发育多样的双链DNA噬菌体抗性的宿主遗传决定因素图谱，以证明菌株特异性差异。作者利用全基因组功能丧失(LOF)和功能获得(GOF)技术，确认了先前描述的噬菌体受体，并揭示了许多未知的拥有对一个或多个噬菌体抗性的宿主因子。作者发现抗性因子的差异与K-12和BL21对特定噬菌体的敏感性密切相关。研究结果表明，宿主可以通过不同的细胞机制响应噬菌体的侵染。作者用于描述噬菌体-宿主相互作用决定因素的系统和高通量遗传工作流程可以拓展到不同细菌，从而生成数据集以预测噬菌体介导的选择如何塑造细菌的表型和进化。利用高通量功能丧失和功能获得技术绘制噬菌体抗性的遗传决定因素 为了比较两种密切相关的实验室模型菌株之间的相似性和差异，作者首先对大肠杆菌菌株K-12(BW25113和MG1655)进行了高通量筛选，然后将其扩展到大肠杆菌菌株BL21(图1)。作者利用大肠杆菌K-12 BW25113的RB-TnSeq库，并定义了大肠杆菌K-12 BW25113的CRISPRi库。为了研究宿主基因剂量和过表达对噬菌体抗性的影响，作者使用了大肠杆菌K-12 BW25113的GOF Dub-seq库。收集了14株具有双链DNA基因组的大肠杆菌噬菌体，其中包括11种被充分研究的典型噬菌体，每种噬菌体具有重叠但不同的宿主识别、进入、复制和宿主裂解机制。
图1 高通量全基因组筛查概述 条形码转座子测序(RB-TnSeq)识别所有14种噬菌体的已知受体和宿主因子 在14株噬菌体上以不同的感染复数(MOI)和9种无噬菌体对照进行了68次RB-TnSeq分析。在侵染测定中，基因适应度分数在不同噬菌体MOIs中是可重复的(图2A)，其中值成对相关性为0.90。由于噬菌体存在时的强选择性，在试验过程采用严格的筛选过滤获得可靠的结果。在所有噬菌体试验中，至少有一个基因具有高置信效应。在一些噬菌体(如T5和T6)的存在下，可以观察到只有一个基因被破坏的菌株富集，而其他噬菌体(如186和λcl857)表现出多个基因被破坏的富集(图2A)。对于使用LPS作为受体的噬菌体，作者发现waa基因簇内的基因突变得分最高，该基因簇编码参与LPS核心生物合成的酶(图2)。例如，waaC、waaD、waaE和lpcA/gmhA在T3和T7噬菌体有最高得分，而waaC、waaD、waaE、waaF、waaJ、waaO、waaQ和lpcA/gmhA在P1、P2和186个噬菌体存在时表现出较高的适应性(图2B)。
图2 14个双链DNA噬菌体在不同MOI下大肠杆菌K-12 RB-TnSeq数据热图 CRISPRi筛选提供了噬菌体抗性决定因素更深层次的观点 为了确认检测系统正确识别了噬菌体侵染中重要的宿主因子，检索了已知影响噬菌体侵染的基因，发现与RB-TnSeq结果中的高适应度得分一致。事实上，得分最高的包括靶向噬菌体受体编码基因及其启动子和转录因子结合位点的小向导RNAs(图3A)。CRISPRi数据也证实了许多在RB-TnSeq筛选中发现的得分最高的基因(图3A)，从而验证了这些基因在特定噬菌体侵染途径中的重要性。与RB-TnSeq一致，作者观察到敲除igaA可产生对10/11噬菌体的抗性(图3B-图3D)。总之，CRISPRi作为RB-TnSeq的补充筛选技术，验证了许多RB-TnSeq的命中，并为研究必需基因和非基因区域在噬菌体侵染中的作用提供了途径。
图3 大肠杆菌非必需和必需基因在不同噬菌体存在下的CRISPRi适应度 Dub-seq可以并行映射噬菌体侵染的多复制抑制因子 Dub-seq分析中观察到的生长益处表型可能不仅仅是由于基因组片段上编码的基因的过度表达，而且由于其他潜在影响，如基因拷贝数（基因剂量）增加，或其他间接显性负效应可能起作用。例如，调节区的过表达或更高的拷贝数可能降低噬菌体受体表达调节中重要的转录因子的有效浓度，并可能导致噬菌体抗性菌株的产生。为了确认方法是否捕获了控制噬菌体受体表达的宿主因子，进一步查找了已知的调控因子(图4)。Dub-seq筛选确定mlc、malY和aes是λ噬菌体存在时得分最高的基因，证实Dub-seq可以识别参与调节噬菌体受体表达的宿主因子(图4A和图4B)。
图4 13个双链DNA噬菌体的Dub-seq筛选数据 LOF和GOF筛选命中的实验验证 （1）CEV1噬菌体在K-12侵染时需要ompF和脂多糖(LPS) 在RB-TnSeq和CRISPRi数据中，ompF、lpcA/gmhA和其他参与LPS生物合成和运输的基因在CEV1噬菌体存在时显示出最高的适应度分数(图2A和图3A)，这与LOF筛选数据一致——作者观察到与对照株相比，ompF和lpcA缺陷株CEV1的EOP值显著降低(图5A)。这些结果表明，CEV1侵染通过识别ompF和LPS核心进行，ompF的缺失或LPS的破坏会导致抗性表型的出现。（2）荚膜异多糖酸生物合成途径的过表达降低了对不同噬菌体的敏感性 目前已知Rcs信号通路可以调节涉及多种功能的基因，包括荚膜异多糖酸的合成和相应细胞膜扰动的生物膜的形成。作者观察到rcsA过表达时，T2、T3、T4、T5、T6、186、λ、CEV1、CEV2、LZ4和N4噬菌体的EOP降低(图5B)。类似的，drsB缺失菌株显示出严重的N4噬菌体敏感性(图5A)。
图5 LOF和GOF筛选中得分最高的基因命中的试验验证 （3）YgbE的过表达使其对T4噬菌体产生抗性，并下调OmpC 在Dub-seq中，ybgE在T4噬菌体存在时表现出最高的适应度分数， EOP数据证实，过表达ygbE时T4噬菌体抗性明显降低(图5B)。为了深入了解噬菌体抗性的机制，作者对ybgE过表达菌株进行了RNA-seq分析，该菌株的差异表达分析显示，T4噬菌体主要受体opmC强烈下调(图6C和图6D)。
图6 RNA-seq分析以深入了解噬菌体抗性机制 （4）环二鸟苷酸是噬菌体N4侵染所必需的 环二鸟苷酸是一种重要的细菌第二信使，参与多种细胞功能的调节。在作者对N4噬菌体抗性的LOF和GOF筛选中，发现催化环二鸟苷酸合成和降解的酶排在前列。为了深入了解特定基因的过表达如何影响噬菌体侵染途径，作者对五种环二鸟苷酸二酯酶过表达菌株进行了差异RNA-seq试验，发现N4噬菌体受体基因nfrA和nfrB无差异表达(图6E和图6F)，表明N4噬菌体抗性表型似乎不是通过N4噬菌体受体基因的转录调节来进行的。因此，环二鸟苷酸如何影响N4噬菌体侵染周期仍需进一步的研究。通过LOF RB-TnSeq和CRISPRi方法绘制了涉及噬菌体侵染和抗性的宿主基因及非基因区域，通过Dub-seq方法揭示了数十种编码不同功能的多复制抑制子，并指出了宿主基因剂量如何影响噬菌体抗性方式。LOF和GOF筛选的数据显示出了一系列MOI的一致性，表明不同的检测方式可以增加不同噬菌体抗性机制的发现，进而组成噬菌体库，并可能快速发现目标宿主中的噬菌体受体。另外，作者的研究结果强调，噬菌体的传染性取决于宿主的细胞生理学特性，特别是LPS和外膜蛋白生物学发生途径所传递的宿主膜特性，通过深入探究可能有利于开发克服广义噬菌体防御机制的治疗方法。本研究中提出的筛选技术能够识别在竞争激烈的自然环境中的噬菌体抗性表型相关的适应度成本，从而提高人们对微生物生态学的总体理解。这种系统层面的理解对于揭示宿主-噬菌体相互作用的新机制，以及开发针对微生物群落干预的不同设计策略，设计高毒力或扩大宿主范围的噬菌体，以及用于治疗应用的合理配方的噬菌体鸡尾酒都是有价值的。论文信息 原名：High-throughput mapping of the phage resistance
landscape in E.coli 译名：大肠杆菌中噬菌体抗性格局的高通量映射 期刊：Plos biology DOI：10.1371/journal.pbio.3000877 发表时间：2020.10 通讯作者：Vivek K. Mutalik 通讯作者单位：Environmental Genomics and Systems Biology Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley,California
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