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撰文丨QY 责编丨迦溆 R-Loop是细胞内的一种特殊的三链核酸结构，包括一条DNA:RNA杂合链（由RNA与其同源DNA序列互补杂交形成）和一条单链DNA。该结构大量存在于基因组的pericentromeric DNA, 端粒, 核糖体DNA以及转录其实以及终止点附近【1】。R-Loop结构是细胞内导致基因组不稳定的主要原因之一，细胞进化出了一套识别并降解R-Loop结构的机制，比如RNase H1。近年来已在多种生物体中发现大量的R-loop结构，其功能已经拓展到了很多关键的生物学，包括染色质开放性，DNA甲基化修饰，组蛋白翻译后修饰、转录调控等多种重要的生物学过程。 细胞内存在大量的R-Loop结构，细胞如何去感知这种结构，一直是这一领域研究的热点。在2017年，哈佛大学医学院的邹力课题组，在Molecular Cell上发表了题为Functions of Replication Protein A as a Sensor of R Loops and a Regulator of RNaseH1 的文章【2】，证实了RPA可以作为细胞内的R-Loop结构的sensor，感知R-Loop结构，并促进RNase H1的活性，从而降解R-Loop结构，维护基因组稳定性。 但是，细胞通过哪些蛋白去感知R-Loop结构，从而调控细胞的表观遗传状态仍不明确。 近日，来自德国的Institute of Molecular Biology (IMB), Mainz的Christof Niehrs教授团队，在Nature Genetics上发表了题为GADD45A binds R-loops and recruits TET1 to CpG island promoters 的文章，首次报道了GADD45A能够识别并结合细胞内的R-Loop结构，作为R-Loop结构的sensor，募集TET1从而介导了CpG 岛的去甲基化，影响基因的表观遗传状态，促进相关基因的转录。 Christof Niehrs团队专注于DNA去甲基化以及DNA损伤修复领域的研究，已经发表了一系列的研究进展。GADD45A蛋白早在1988年被克隆出来，作为p53的下游基因之一，在DNA损伤修复，基因组稳定性维护以及细胞周期调控等方面具有重要的作用。2007年，Christof Niehrs团队在Nature杂志发表了题为Gadd45a promotes epigenetic gene activation by repair-mediated DNA demethylation的文章【3】，利用大规模筛选的方式，筛选能够激活被 DNA甲基化沉默的荧光素酶报告基因的蛋白。筛选到了GADD45A蛋白能够促进DNA修复途径介导的 DNA 去甲基化。Christof Niehrs实验室后续的研究说明了GADD45A能够与TET1结合，并且促进其去甲基化功能。但是对于GADD45A是通过一种什么样的机制被募集到DNA甲基化位点，目前仍不明确，Christof Niehrs实验室抑制致力于寻找相关的详细分子机制，14年进一步发表了Long Noncoding RNA TARID Directs Demethylation and Activation of the Tumor Suppressor TCF21 via GADD45A 的文章【4】，说明了细胞内的LncRNA TARID能够通过结合GADD45A并且募集TET1到TCF21基因的promoter区域，介导TCF21的promoter的去甲基化，促进肿瘤抑制基因TCF21 的表达，从而发挥抑癌作用。但是对于GADD45A 如何被富集过去，这一问题似乎仍未得到解决。 作者为了回答这一困扰多年的问题，详细分析了TARID与TCF21基因转录起始点（TSS）的碱基序列，作者发现，这一区域在TCF21基因的promoter区域存在CpG岛的结构，该区域GC含量较高，这种结构区域通常会在转录过程中形成R-Loop的特殊结构。因此，作者应用了S9.6抗体（能够特异性识别R-Loop结构的抗体），使用DRIP的方法去检测此区域是否真的存在R-Loop结构，作者发现，在这一区域内的确实存在R-Loop结构。作者在14年的文章中构建了Transcgenic的WT以及TARID mutant的293 cell line，在WT细胞中能够检测到R-Loop的结构，但是在TARID mutant的细胞中，几乎检测不到该结构。以上实验提示了在TCF21基因的启动子的区域的CpG岛处确实会形成R-Loop结构，并且这种R-Loop结构的形成是依赖于LncRNA TARID 的。 作者为了明确R-Loop结构在TCF21基因promoter区域的精确位点，进一步使用了R-Loop footprinting 的方法（该方法由清华大学孙前文研究员在2013年的Science paper中使用，该文章也引用了此文章【5】），发现了-7到+62位的碱基（相对于TSS）的anti-sense strand处于单链的状态。这个区域正好与TCF21基因的启动子的区域的CpG岛重叠。另外，作者发现在细胞中过表达TARID后，在该位点会形成大量的R-Loop结构，同时该位点的甲基化水平也会显著降低。 以上的实验结果进一步证实了作者之前的结果，TARID确实会导致TCF21的启动子区域的CpG岛的去甲基化，同时这种去甲基化状态与该区域的R-Loop结构是相关联的。 作者长期致力于GADD45A蛋白功能的研究， GADD45A 能够结合到该位点，并且进一步招募TET1酶对这一区域的甲基化C去甲基化，但是其具体的机制尚不明确。作者大胆地提出了GADD45A能够直接结合形成的R-Loop的结构，从而招募去甲基化酶对R-Loop结构区域进行去甲基化作用的假设。为了验证该假设，作者设计了一系列的精细的实验来证明。首先， ChIP实验证实，GADD45A确实只能结合到TCF21启动子的形成R-Loop结构的区域，并且这种结合在过表达RNase H1后会显著降低。第二，作者在体外合成了R-Loop的结构，使用Pull-down的方法证实了GADD45A确实能够与R-Loop结合，同时这种结合不能够被RNase A消除，但是能够被RNase H1消除，次外，作者还使用EMSA， northern blot以及IP的方式的证实了GADD45A确实能够与R-Loop结合。通过以上多种实验手段，作者强有力地证实了GADD45A确实能够与R-Loop结合，并且与R-Loop结构中的DNA序列无关。 从TARID以及TCF21基因在基因组上的位置来看，两者如果同时转录，将会出现两个RNA聚合酶的head-to-head collision，因此推测两者不能同时进行转录。作者检测了在细胞周期的不同时间段检测TARID以及TCF21基因的转录水平，发现TARID的转录先于TCF21基因，TARID在细胞周期的S期转录达到峰值，而TCF21基因在G2/M 期的转录才到峰值。有趣的是，作者发现，随着TARID转录的增多，位于TCF21基因的promoter 的CpG岛处的R-Loop水平逐渐升高，同样的，GADD45A以及TET1与该区域的结合也逐渐升高。另外，该位点的5hmC水平也随着TARID的转录水平逐渐升高，提示了在该区域由于TARID的转录，形成了较多的R-Loop结构，R-Loop结构被细胞内的GADD45A所结合，招募TET1到TCF21基因的启动子区域催化此位点去甲基化的发生，从而促进了TCF21基因的转录。 以上的结果提示了细胞内的全新的R-Loop结构的sensor——GADD45A通过结合R-Loop，募集去甲基化酶对调节相关基因的表观遗传状态。为了验证这一假设，作者使用TET1 ChIP-seq从基因组范围内mapping在基因组范围内的结合位点与R-Loop的关系。作者发现，有大约4%的TET1的ChIP-seq Peaks 在RNase H1的处理后会显著降低，提示了这些区域TET1可能确实是被R-Loop结构所募集，进一步将这些RNase H1敏感的peaks 与之前的基因组上的R-Loop区域比对，54%的peaks与报道的R-Loop是overlap的，并且大多数处于基因TSS附近的 CpG岛上。通过以上数据，证明了基因TSS附近的 CpG岛处形成的R-Loop能够招募TET1去甲基化酶，从而影响基因的表观遗传状态。 为了验证TET1招募到R-Loop区域是依赖GADD45A的，作者使用ChIP-qPCR的手段，证实了GADD45A募集到富含R-Loop的启动子区域是依赖于R-Loop结构的，同时TET1的募集是依赖于GADD45A的。 作者在此处缺少了一个关键GADD45A的ChIP-seq数据，以及S9.6抗体的DRIP-seq或者使用Catalytically dead RNaes H1 ChIP-seq（该方法由华人生物学家付向东教授课题组开发，文章第一作者陈亮博士现在是武汉大学研究员，致力于转录过程中形成的特殊DNA／RNA杂合链结构R-loop的动态调节机制、生物学功能以及在疾病发生中的作用机制）的方式，mapping TET1以及GADD45A 的ChIP-seq的peaks，以及在敲除GADD45A前后TET1的ChIP-seq的对比。 这篇文章也提出了较多的问题，比如：GADD45A在体外能够与R-Loop结合，而且不依赖于DNA的序列，但是在基因组范围内TET1只与一小部分的R-Loop结构结合，这提示了GADD45A在体内是具有一定的特异性的，是否LncRNA产生的R-Loop结构与转录过程中所形成的R-Loop结构有一定的区别。但是这些留下的问题并不妨碍这篇文章的创新性，从而能以Letter的形式发表在Nature genetics上。 综上，这篇文章揭示了GADD45A全新的功能，即作为细胞内promoter区域的R-Loop结构的reader，并且能够招募DNA去甲基化酶TET1，从而影响基因的表观遗传状态。为之前的研究，R-Loop能够影响DNA甲基化状态提供了可能的分子机制。也未后续的寻找更多的R-Loop结构的sensor以及其与组蛋白修饰，染色质开放性等关系提供了全新的思路。 近年来，R-Loop的研究已经成为热门领域，开始重新审视R-Loop的功能，证明了R-Loop不在是简单的转录过程的副产物，也不再简单认为R-Loop结构是有害的，其功能已经拓展到了DNA损伤修复机制的选择（陈亮研究员解读，Cell期刊上发表了一篇题为Human Rad52 Promotes XPG-Mediated R-loop Processing to Initiate Transcription-Associated Homologous Recombination Repair【6】，陈亮解读Cell丨R-loop影响DNA损伤修复机制的选择），调控基因转录，表观遗传状态，有丝分裂染色体分离等领域。值得一提的是，华人在这个领域做出了很多非常漂亮的工作，比如邹力课题组发现RPA1作为R-Loop的sensor 能够募集RNase H1从而维护基因组稳定性，以及去年一月份发表在Science杂志的A mitosis-specific and R loop–driven ATR pathway promotes faithful chromosome segregation文章【7】，揭示了位于着丝粒处R-Loop在维护有丝分裂过程中染色体正确分离重要功能。清华大学孙前文研究员在植物R-loop的形成、稳定与解除的分子机理中也发表了一系列高水平的文章（清华孙前文组关于R-Loop系列重要工作概览；清华孙前文组报道精准、高效、高通量检测R-loop分布的新方法）。陈亮研究员在R-loop的动态调节机制、生物学功能，新技术方法的开发发表了系列工作）。 原文链接： https://www./articles/s41588-018-0306-6 参考文献： 1. J. M. Santos-Pereira, A. J. N. R. G. Aguilera, R loops: new modulators of genome dynamics and function. 16, 583 (2015). 2. H. D. Nguyen et al., Functions of replication protein A as a sensor of R loops and a regulator of RNaseH1. 65, 832-847. e834 (2017). 3. G. Barreto et al., Gadd45a promotes epigenetic gene activation by repair-mediated DNA demethylation. 445, 671 (2007). 4. K. Arab et al., Long noncoding RNA TARID directs demethylation and activation of the tumor suppressor TCF21 via GADD45A. 55, 604-614 (2014). 5. Q. Sun, T. Csorba, K. Skourti-Stathaki, N. J. Proudfoot, C. J. S. Dean, R-loop stabilization represses antisense transcription at the Arabidopsis FLC locus. 340, 619-621 (2013). 6. T. Yasuhara et al., Human Rad52 Promotes XPG-Mediated R-loop Processing to Initiate Transcription-Associated Homologous Recombination Repair. 175, 558-570. e511 (2018). 7. L. Kabeche, H. D. Nguyen, R. Buisson, L. J. S. Zou, A mitosis-specific and R loop–driven ATR pathway promotes faithful chromosome segregation. 359, 108-114 (2018). 制版人：子阳 |
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