淋巴细胞的分离和激化实验

一、实验试剂

1.  PBS（Dulbecco）：

0.10 g/L 无水CaCl₂

0.20 g/L KCl

0.20 g/L KHPO₄

0.10 g/L MgCl₂.6H₂O

8.00 g/L NaCl

2.16 g/L NaH₂PO₄.7H₂O

调pH至7.4

2. 生长培养基：

不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基

10% FBS

庆大霉素（可不用）（10 μg/ml）

2 mmol/L L-谷氨酰胺

1 mmol/L 丙酮酸钠

3. 促细胞分裂剂（终浓度）

5 μg/ml PHA：1 mg/ml母液-20℃分装冻存

25 μg/ml 刀豆凝集素A（conA）：0.4 mg/ml母液-20℃分装冻存

商陆促分裂原：再水华母液-20℃分装冻存
 

二、实验步骤

1.  收集10 ml全血，加入不含防腐剂的肝素（0.2 ml肝素/10 ml全血）。实验全过程保持无菌操作。

2.  在15 ml离心管中的肝素化血中加入1 ml 6%葡萄糖，室温放置20~30 min，沉降红细胞。沉降时间不宜过长，否则单核细胞将不再保留在富含白细胞的血浆。

3.  从葡聚糖处理的血中小心收集红细胞上层的富含白细胞的血浆。

4.  富含白细胞的血浆室温300 g离心8 min，沉淀细胞。

5.  弃上清，细胞轻悬于1 ml PBS中。

6.  于室温下，用无菌巴斯德吸管小心将细胞悬液加在5ml Ficoll-Hypaque之上。此步操作要技术熟练，才能保持血浆曾在Ficoll-Hypaque层之间界面清晰。

7.  400 g低温（4℃）离心30 min，沉淀细胞。离心后切记不要破坏管中的分层。

8.  淋巴细胞在血浆和Ficoll-Hypaque层之间的白色浑浊条带中，小心取出贮存，弃红细胞沉淀。

9.  5 ml PBS洗一次细胞，室温250 g离心5 min，沉淀细胞悬于3~5 ml生长培养基中。

10.  全部细胞悬液转移至T25组织培养瓶，加促细胞分裂剂。