科研进展：miRNA通过AGO2调控circRNA表达

circRNA通过吸附miRNA发挥作用的文章已经比较多了，今天我们来看一篇miRNA调控circRNA的文章：

MicroRNA-1224 splicing circularRNA-Filip1l in an Ago2- dependent manner regulates chronic inflammatory pain via targeting Ubr5. J Neurosci. 2019 Jan 16. pii: 1631-18. doi: 10.1523/JNEUROSCI.1631-18.2018.

microRNA-1224介导Ago2剪接调控circRNA-Filip1l通过靶向Ubr5调控慢性疼痛

论文第一作者为潘志强教授、硕士生李国芳和孙梦兰，曹君利教授和潘志强教授为共同通讯作者：

来源:徐州医科大学官网

http://www./info/14625/253482.htm

一、研究背景

• miRNA通过AGO2调控circRNA表达已有文章：

miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circularantisense RNA.EMBO J. 2011 Sep 30;30(21):4414-22. doi: 10.1038/emboj.2011.359.

在这篇文章中，miR-671通过Ago2调控CDR1的circRNA发挥功能：

• MicroRNA-1224在中枢神经系统中表达丰度较高，且与帕金森症有关；

• circRNA-Filip1l在脑组织高表达；

二、文章思路和结果

1. circRNA-Filip1l的确定及基本特性研究

• 首先通过芯片对CFA诱导的慢性炎症疼痛的小鼠与对照组进行检测，共找到16个显著上调和34个显著下调2倍以上的circRNA，其中CircRNA-005252显著差异倍数最高，另外又随机挑选了1条显著升高和2条显著降低的circRNA通过PCR进行验证，CircRNA-005252表达倍数显著上调2.8倍；

• 接下来对CircRNA-005252进行PCR扩增后进行Sanger测序，并检测CircRNA-005252对RNase R降解的敏感性；

• 然后通过Northern Blot检测CircRNA-005252；

• 最后细胞质核分离后PCR和荧光原位杂交检测CircRNA-005252的细胞内定位与分布，结果发现胞浆和胞核均有分布。

2. circRNA-Filip1l的时序和细胞/区域表达特异性检测

• 首先是在CFA诱导的慢性炎症疼痛模型中circRNA-Filip1l表达的时序（2h-1d-3d-5d-7d-14d）和脊髓背侧角和脊髓前角表达的区域特性；

• 接下来是在CCI小鼠模型中的表达，结果发现circRNA-Filip1l不仅在慢性炎性疼痛（CFA）还在慢性神经病理性疼痛（CCI）中发挥作用；

• 最后是circRNA-Filip1l在神经元、星形胶质和小胶质细胞的分布，结果发现在circRNA-Filip1l主要在神经元内分布。

3. circRNA-Filip1l对疼痛感受的影响

这里就是我们常说的细胞和动物水平的功能实验了，对circRNA-Filip1l分别进行沉默和过表达（各用两种技术），然后检测温度和机械疼痛表型。

4. circRNA-Filip1l的表达被miR-1224调控 

• 由于circRNA-Filip1l定位于细胞核，而研究发现（背景介绍中的EMBO J 文章）miRNA可通过结合细胞核内的circRNA调控其表达，因此考虑从miRNA角度研究circRNA-Filip1l表达调控机制；
  

• 对circRNA-Filip1l和前体circRNA-Filip1l的序列预测发现miRNA-1224；

• miRNA-1224也定位于细胞核，且时序/细胞表达模式与circRNA-Filip1l类似；

• 通过双荧光素酶报告基因实验和生物素标记的miRNA-1224进行pulldown检测；

• 最后对miRNA-1224的表达进行干预后检测circRNA-Filip1l表达。

5. miR-1224通过circRNA-Filip1l调控疼痛感知

这里的工作主要就是围绕miR-1224展开了，有点像circRNA-Filip1l的功能研究，我们单独看为了证明miR-1224通过circRNA-Filip1l发挥作用，这个回复实验是怎么做的：

6. Ago2介导miR-1224对circRNA-Filip1l的剪切

• 之所以考虑Ago2，原因还是EMBO J文章；

• 通过荧光素酶报告基因实验研究Ago2对miRNA-1224调控circRNA-Filip1l的影响；

• Ago2的抗体进行RIP发现miRNA-1224和pre-circRNA-Filip1l；

• 通过功能实验和回复实验进一步证明Ago2在miRNA-1224调控circRNA-Filip1l的作用。

7.CircRNA-Filip1l通过调控Ubr5表达发挥作用

前面的工作主要围绕circRNA-Filip1l的上游机制展开，建立了miRNA-1224/Ago2/circRNA-Filip1l的调控轴，这一部分主要讲的是circRNA-Filip1l的下游机制和靶基因。

• 研究发现核circRNA通过招募RNA聚合酶II调控基因表达，因此考虑circRNA-Filip1l是否存在这样的作用机制；

• 通过BLAST 对circRNA-Filip1l的可能靶基因进行预测，在预测到的42个基因中，寻找与疼痛有关的分子，其中Ubr5可活化NMDA受体；

• 接下来是对circRNA-Filip1l调控Ubr5的验证了，这里包括了circRNA-Filip1l与Ubr5结合位点的预测、荧光素酶报告基因实验研究circRNA-Filip1l对Ubr5转录活性的调控、circRNA-Filip1l对Ubr5表达的影响、Ubr5与miRNA-1224/Ago2/circRNA-Filip1l等表达的相关性以及Ubr5的功能等。

三、文章总结

通过示意图来展示文章的研究结果：

最后我们抛砖引玉说一下对这篇文章的理解：

1. 如同题目所说，这篇文章说的是miRNA对circRNA的调控，circRNA吸附miRNA的研究比较多，而反过来的调控模式则比较少。另外，这里还涉及到circRNA的表达异常的几种机制，如果感兴趣可以看这些综述：

• The Biogenesis, Functions, and Challenges of Circular RNAs.Mol Cell. 2018 Aug 2;71(3):428-442. 

• Regulation of circRNA biogenesis.RNA Biol. 2015;12(4):381-8.

• A 360° view of circular RNAs: From biogenesis to functions.Wiley Interdiscip Rev RNA. 2018 Jul;9(4):e1478. 

2. circRNA的下游调控方式：在这篇文章中circRNA通过招募Pol II调控靶基因转录，这种作用方式已经在lncRNA里面有研究，但在circRNA的作用机制里面还是相对较少的；

3. 移植研究的一种模式：从基础研究找思路，到对应的疾病中去。

４. 这篇文章的工作量不少，发表的杂志分数（IF 5.97）似乎低了一些？