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基因工程 1.确定限制酶的种类 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类: ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。 如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)切割。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以确保产生相同的黏性末端(或平末端)。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏一些相关结构,如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因; 如果所选酶的切点不只一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 2.基因表达载体中启动子、终止子的来源 (1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的,在构建基因表达载体时,不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子,因为目的基因中已含有启动子、终止子。 (2)如果目的基因是通过人工方法合成的,或从cDNA文库中获得的,则目的基因是不含启动子和终止子的。 若只将基因的编码序列导入受体生物中,目的基因没有启动子、终止子,是无法转录的。 因此,在构建基因表达载体时,需要在与质粒结合之前,在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。 3.载体上标记基因的标记原理 标记基因种类多种多样,主要包括抗性基因、颜色反应基因、代谢缺陷型互补基因等。 不同类型的标记基因,其应用原理也有较大的差异。 例如: (1)抗生素的抗性基因 目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。 当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素。 所以，在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞。 原理如下图所示: (2)颜色反应基因 颜色反应基因主要包括蓝白斑筛选相关基因(如LacZ基因)、绿色荧光蛋白基因(如GFP基因)、β-葡萄糖酸苷酶和荧光素酶基因。 蓝白斑标记筛选原理是载体中含有LacZ基因,外源DNA克隆位点位于载体中的LacZ基因内部。 若无外源DNA分子插入,LacZ基因在IPTG诱导下,表达的β-半乳糖苷酶能够将X-gal分解为蓝色产物,使菌落呈蓝色; 若外源DNA分子成功插入运载体中,LacZ基因失活,因不能表达有活性的β-半乳糖苷酶,在培养基上形成的菌落为白色。 因此,可以根据菌落蓝白颜色的不同,筛选出需要的转化子。 4.几种目的基因获取方法的比较 克隆技术 有关克隆技术的 一、克隆技术与生殖类型 在识别生殖方式时,应遵循以下思路: 首先看有无精卵结合过程: 1.若有,则为有性生殖,如卵式生殖和接合生殖(水绵)。 2.若无,看有无生殖细胞产生: (1)若无,则为无性生殖,如分裂生殖、出芽生殖、营养生殖。 (2)若有,看生殖细胞的形成是否经过了减数分裂: ①否,为无性生殖,如孢子生殖; ②是,为有性生殖,如单性生殖(雄蜂的产生、花药离体培养得到单倍体植株)。 因为克隆过程中既没有生殖细胞的结合,也没有涉及生殖细胞的形成,所以通过克隆技术形成新个体的过程属于无性生殖。 二、课本中涉及的不同操作水平的克隆技术 1.分子水平上的克隆 (1)含义:将某一特定的DNA分子或DNA片段在受体细胞中进行自我复制得到大量完全相同的该DNA或DNA片段的“群体”。 (2)实例:DNA分子的复制。 (3)实践应用:基因工程操作中的目的基因的扩增过程。 2.细胞水平上的克隆 (1)含义:由一个单一的共同祖先细胞分裂形成一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。 (2)实例:细胞的有丝分裂、无丝分裂、二分裂。 (3)实践应用:细胞工程中动物细胞的培养。 单克隆抗体的生产需动物细胞培养技术手段的支持。 3.个体水平上的克隆 (1)含义:指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体,其理论基础是细胞的全能性。 不同的细胞全能性表现不同,一般情况下遵循以下规律:
(2)实例: ①植物个体水平上的克隆:植物的组织培养技术以及营养生殖都可以看做是植物的克隆过程。 植物体细胞杂交、抗虫棉的培育等过程需植物组织培养技术手段的支持。 ②动物个体水平上的克隆:核移植、同卵双胞胎和动物胚胎的分割移植。 注:各种无性生殖方式也应属于克隆的范畴,如病毒的繁殖应属于分子水平的克隆; 分裂生殖可以看成是细胞水平的克隆,也可以看成是个体水平的克隆; 出芽生殖、孢子生殖和植物的营养生殖应属于个体水平的克隆。 胚胎工程与生态工程 一、胚胎工程中的高频易错点归纳 1.卵裂阶段物质含量和体积大小的变化 (1)卵裂阶段的细胞分裂方式——有丝分裂。 (2)受卵膜制约,从受精卵到囊胚阶段总体积不变或略有减小,所以每个细胞体积减小。 (3)伴随细胞分裂,细胞数目增多,总DNA含量增多,但每个细胞中DNA含量保持相对稳定。 (4)该过程中有机物总量减少,因为一直呼吸消耗但不从外界吸收。 2.试管婴儿、设计试管婴儿与克隆技术 (1)试管婴儿技术与克隆技术的区别: 试管婴儿技术的生物学原理是有性生殖(又称为体外受精技术)。 克隆技术的生物学原理是无性生殖(又称为体细胞核移植技术)。 (2)试管婴儿与设计试管婴儿的区别 上述过程①②③是为解决不孕夫妇生育问题而出现的普通试管婴儿的培育过程; ①②④⑤为设计试管婴儿的过程,后者比前者多了胚胎移植前的遗传学诊断。 二、生态工程易错点分析 1.对一些生态工程具体实例所用的生态学原理辨析不清 (1)单一人工林比天然混合林稳定性低,易暴发虫害——物种多样性原理。 (2)草原确定合理载畜量,不能过度放牧——协调与平衡原理。 (3)引种考虑适应环境——协调与平衡原理。 (4)系统各组分之间要有适当的比例关系——系统整体性原理。 (5)整体性原理 (6)整体性原理和系统整体性原理的比较 整体性原理指社会、经济、自然三方面协调统一,保障整个系统的稳定性与平衡。 例如：林业建设中自然系统、社会系统与经济系统的关系问题,即种树的同时考虑经济收入、粮食、燃料等问题。 系统整体性原理指整体大于部分之和,即1+1>2。目的是保持系统有很高的生产力。 2.正确认识石油农业与污染物 (1)正确认识“石油农业” “石油农业”是大量使用化肥、农药和机械的生产方式,因对石油等能源有高度的依赖性而得名。 它把农业生产这一复杂的生物过程,变成了简单的机械过程和化学过程。 由于其投入高,产出也高,对粮食安全保障和提高人民生活水平起到了巨大的作用； 但同时它所产生的废弃物和有害物质的数量也很庞大,大大削弱了农业生态系统的稳定性和持续生产力,并造成日益严重的农产品污染和环境污染等问题。 (2)“污染物是放错地方的资源” 对环境造成危害的污染物,采取一定的措施和技术,就能够进行回收和循环利用,这样不但能够减少环境污染,而且提高了资源的利用效率,减少了资源的浪费。 例如,对污水中的重金属或氮、磷等成分就可以进行回收再利用。 因此说污染物是放错了地方、没有被利用的资源。 |
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