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质粒构建详尽版（三） 一 载体的定义 即要把一个有用的基因（目的基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。细菌质粒如pCMV系列、pUC系列、pGEX系列等，噬菌体载体如λ类噬菌体、M13噬菌体等，动植物病毒如慢病毒、假病毒等。其中在细胞分子生物实验室中细菌质粒载体应用最多。前文我们已具体讲过质粒载体的构建，未看到的小伙伴可以查看历史文章。 二 质粒载体的分类 按功能分类：（1）克隆载体：都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨性载体。（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori, Ampr, Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体：原核表达载体，能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行表达的载体。（2）真核载体：真核表达载体，能携带插入的外源核酸序列进入真核细胞中进行表达的载体。（3）穿梭载体：指可以在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因穿梭于两种生物之间，穿梭质粒含有原核和真核生物2个复制子，以确保其在两类细胞中都能扩增。 三 原核载体（pGEX-4T-1-3×HA）简介 如上质粒是在质粒pGEX-4T-1的基础上在其原本的GST标签末端加了3个连续的HA标签构建而成。整个质粒的功能元件为：ori是质粒的复制起点；lacI promoter是lacI基因的启动子；lacI是原核生物表达的功能蛋白，与质粒DNA的拓扑结构相关；lac promoter是lac基因的启动子；M13 fwd和rev是M13上下游通用引物，可用于后续测序；lacZα是lacZ基因α亚基，可用于蓝白斑筛选等；tac promoter是tac启动子，用于启动后续基因表达；GST是谷胱甘肽S-转移酶标签，作为一种标记蛋白或多肽的标签，用于蛋白纯化或蛋白相互作用研究等；3×HA是3个连续的HA标签，HA标签是一种常用的短肽段标签，真核表达也较常用，标签短可不影响外源表达的蛋白功能，可用于外源表达蛋白的定位、表达、相互作用等研究；其后的密集的限制性酶切位点区域即为多克隆位点（MCS）区域；其后是氨苄抗性的启动子及表达基因，用于菌落筛选转化成功的细菌。 四 穿梭载体（pCMV-HA）简介 与原核载体相比，多了很多真核表达的功能元件：CMV promoter是真核转录的启动子；SV40是有助于真核细胞转染的大T抗原；还有真核转录的poly(A)等。其他元件基本与原核载体相同有利于在原核生物内复制及相关原核基因的表达。 质粒查询网址 http://www./ 相关推荐 |
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