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什么是荧光素酶报告基因？ 报告基因是一个分子生物学概念，它是指一类在研究对象处于特定情况下才会表达并且表达产物易于检测的基因。将报告基因与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。这项技术灵敏度高、检测简便可靠、适于大规模生产，因而在监测细胞信号转导，基因表达和药物筛选等方面得到广泛应用。一般的报告基因需要满足以下几个条件：①全序列已知，可以克隆；②表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景；③其表达产物能进行定量测定。 荧光素酶报告基因就是一种常用的报告基因。 荧光素基因表达的荧光素酶能在氧气和ATP存在的情况下催化荧光素发光。无需激发，检测线性范围广，灵敏度高，而且在哺乳动物中无内源性表达，所以用作报告基因非常合适。荧光素酶基因有多种来源，目前，以北美萤火虫来源的荧光素酶基因应用最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。 如何使用荧光素酶报告基因？ 1. 构建报告质粒：把荧光素酶基因克隆至表达质粒，如果研究启动子强弱或转录因子对启动子的作用，那么就在荧光素酶的5'端加上待检测启动子序列或者有转录因子结合位点的启动子；如果想检测miRNA对于目的基因的抑制作用，就可以在荧光素酶3'端加上目的基因的3'UTR。
3. 对细胞施加不同的外界条件，或者外源转入抑制物、转录因子表达质粒等。 4. 用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞荧光值。 5. 数据分析，得出结论。 荧光素酶报告基因应用有哪些？ 1. 潜在启动子/启动子核心区域检测； 2. 潜在增强子/抑制子等调控子核心元检测； 3. 启动子区可能的转录因子结合位点检测； 4. 启动子/增强子与转录因子的相互作用； 5. 病毒/细胞相互作用； 6. 药物等化学诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）； 7. 射线等物理诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）。 应用举例 NLRP3基因3'UTR双荧光素酶报告质粒的构建及miR-22-3p靶向调控[1] 实验方法： 应用生物信息软件预测 miＲ－22－3p 与 NL-ＲP3 基因的结合位点; 将 NLＲP3 基因的 3'UTＲ 序列及其突变体克隆到双荧光素酶报告基因载体 psiCHECK2中，构建野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒载体，采用PCR及基因测序方法鉴定载体是否构建成功; 将培养的人胚肾 293T 细( HEK293T) 分为 4 组: （1）miＲ－22－3p 对照 + psiCHECK2; （2） miＲ－22－3p 对照 + psiCHECK2－NLＲP3－3'UTＲ( 野生型) ; （3） miＲ－22－3p 模拟( mimic) + psiCHECK2－NLＲP3－3'UTＲ( 野生型) ; （4）miＲ－22－3p 模拟( mimic) + psiCHECK2－NLＲP3－3'UTＲmut( 突变型) ，分别检测细胞荧光素酶活性。 Protocol 1. 生物信息软件预测 miＲDB 数据库以及网站 http: / /34. 236. 212. 39 /microrna /home. do 预 测miＲ-22-3p 与 NLＲP3 可能的靶向结合位点。 2. 重组NLＲP3－3'非编码区野生型载体psiCHECK2－NLＲP3－3'UTＲ的构建 小 量 提 取 质 粒PUC57-NLＲP3-3'UTＲ后用 NotⅠ和 XhoⅠ进行双酶切，回收 NLＲP3-3'UTＲ 片段; NLＲP3-3'UTＲ片段与载psiCHECK2 在 T4 DNA 连接酶的作用下连接过夜，连接产物转化 DH5α 感受态细胞，挑选阳性单菌落接种培养，菌液做 PCＲ 鉴定及测序。 3.重组 NLＲP3 -3'UTＲ 突变型载体 psiCHECK2-NLＲP3-3'UTＲmut的构建 根据 NLＲP3 的编码序列设计的点突变引物以 psiCHECK2-NLＲP3-3'UTＲ为模板，采用 PCＲ 的方法获得 psiCHECK2-NLＲP3-3'UTＲmut，PCＲ 完成后进行1%琼脂糖凝胶电泳，限制性内切酶 Dpn Ⅰ酶切 PCＲ 产物，酶切产物转化 DH5α 感受态细胞，挑选阳性单菌落接种培养，菌液做 PCＲ 鉴定及测序。 4. 细胞转染 HEK293T 细胞，用含 10% 胎牛血清的 DMEM培养基，于 37℃ 5% CO2 培养箱中培养，取处于对数生长期，生长状态良好的细胞，以每孔 5 × 105 /孔的细胞密度分别接种于 6 孔板，37℃培养过夜; 当细胞汇合 70% 左右时开始转染，转染前 2 h，换成无血清DMEM 培养基，参照 LipofectamineTM 2000 转染试剂说明书进行转染，实验分为下列 4 组: （1） miＲ－22－3p 对照 +psiCHECK2; （2） miＲ－22－3p 对照+ psiCHECK2－NLＲP3－3'UTＲ( 野生型) ; （3） miＲ－22－3p 模拟物( mimic) + psiCHECK2－NLＲP3－3'UTＲ ( 野生型) ; （4） miＲ－22－3p 模拟物( mimic) + psiCHECK2－NLＲP3－ 3'UTＲmut( 突变型) ，每组设 3 个平行孔，实验重复 3 次。 5. 双荧光素酶活性检测 转染后48 h 吸尽细胞培养液加入细胞裂解液充分裂解细胞，10 000 ～15 000 × g离心3～5 min，取上清用于测定。按双荧光素酶报告基因检测试剂盒提供实验方案，分别测定萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的活性，计算两者的比值，代表相对荧光素酶活性。 参考文献 [1] 伍军,李相友,朱戈丽,张艳霞,毕智敏.NLRP3基因3'UTR双荧光素酶报告质粒的构建及miR-22-3p靶向调控[J].广东医学,2018,39(23):3463-3468. |
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