如何从小鼠脾脏制备单细胞悬液？

从原代组织样本中制备真正的单细胞悬浮液可避免过量的细胞损失并且能够最大化标记靶细胞，从而优化细胞分选。以下实验步骤概述了如何从脾脏样本中收集细胞，并制备成单细胞悬液以进行下游细胞分选。

实验步骤

1. 将脾脏组织转移到35 mm无菌培养皿（产品号 #27100/27150）中。后续如需进行细胞分选，在培养皿中加入5 mL推荐培养基（请参阅试剂盒产品说明书）。如解离组织后不需细胞分选，请在培养皿中加入含1 mM EDTA的PBS。

注意: 如同时处理多个脾脏样本，需使用100 mm培养皿（产品号 #27125/27127），并加入10 mL培养基。

2. 去除脾脏组织上的结缔组织或脂肪，注意坏死区域，并检查脾脏是否有肿大、变色或病变。记录起始样本的状态对于后期评估细胞非常重要。

3. 从3 cc无菌注射器（产品号 #28230/28240）中取出活塞/柱塞。使用扁平的末端部分以温和画圆的方式研磨脾脏5次。这样可以破坏脾脏和髓质，释放脾细胞。

4. 将一个70 μm细胞过滤器（产品号 #27216/27260）置于50 mL无菌锥形管上，并用2 mL推荐培养基润洗滤网。

注意：细胞可能会黏附于干燥的滤网上，润洗滤网可以减少这种情况 。

5. 使用润洗过的5 mL或10 mL移液管将脾细胞吹打均匀。

6. 将上清液和组织从培养皿转移至润洗过的70μm细胞过滤器（产品号 #27216/27260）。使用一个新的3 cc无菌注射器的活塞/柱塞，以温和画圆的方式使细胞和组织通过滤网。用3 mL推荐培养基冲洗滤网。

• 如需提高回收率，可选择进行此步骤：

  a. 只将上清液而不要将脾脏组织移入过滤器。在培养皿中另加入5 mL推荐培养基。

  注意：如果一次处理多个脾脏可加入10 mL推荐培养基。

  b. 重复步骤4-6，在培养皿中加入推荐培养基（5 mL或10 mL）直至脾脏组织变白且培养基呈现澄清状态。

7. 使用3 mL推荐培养基再次冲洗滤网。

8. 离心300 x g，10分钟来收集细胞。

9. 小心弃去上清。

10. 轻轻敲击试管重悬细胞。

11. 如有需要，可在试管中加入40 mL推荐培养基，进行第二次洗涤。重复步骤8-10。

12. 脾细胞可用于下游应用。无需去除红细胞！

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