|
感兴趣的伙伴们，可回顾前贴《NGS文库质量之“兵器谱”》 其中有一款仪器Agilent2100，若以兵器谱比之，当为七种武器之“碧玉刀” -精准可量化。结果华美可靠！ Agilent2100及其类似产品  原理：毛细管电泳 检测目的：文库不同长度的分子片段的分布情况是否合适。如小片段过多，或文库长度过长皆会影响后续测序实验。 优点：精准；结果可量化；可形成图表报告。 缺点：需购买配套的芯片和胶。小贵！ 总结：凝胶电泳的土豪版。追求质量的选用 为方便同好掌握，特分享agilent2100 SOP操作手册 Agilent 2100 操作SOP 1实验目的：微电泳系统，通过检测荧光度，对核酸进行分析 2 使用范围：构建好的文库 3 实验步骤： 3.1芯片制备器的准备： 3.1.1 芯片槽的设定：将芯片的槽固定在位置C（实验为DNA，若是RNA或者蛋白则有其他位置，本实验全部固定于C，请勿移动位置） 3.1.2 注胶器档位设定：将位置固定于最下端的档位（实验为DNA，若是RNA或者蛋白则有其他位置，本实验全部固定于最下档，请勿移动位置） 3.1.3 注射器的位置：固定在1ml处，勿动！！（注：正式使用前需检查密闭性，即用注射器瞬间压下后放开，观察其自动升起的高度，如达到6以上则为合格，6以下说明有漏气需重新放置或拧紧注射器） 3.1.4 芯片混匀仪的设定：调制最大转速，勿动！（其自动设定为1min，制备芯片完毕后，放于槽内，其会在1min时自动停止） 3.2 试剂制备 3.2.1 将试剂盒从冷藏室内取出，避光放于室温环境下，至少30min。（试剂必须放置在室温30min平衡，否则会影响后续的实验，对结果产生严重影响） 3.2.2 试剂混合：从试剂盒中取出High Sensitivity DNA dye concentrate（上盖是蓝色的），将其涡旋混匀10 S，使其中的DMSO充分混匀。稍微离心使液体进入管底。 3.2.3 取15 μl High Sensitivity DNA dye concentrate（上盖是蓝色的）加入到High Sensitivity DNA gel Matrix vial（上盖是红色的），稍微涡旋混匀。 3.2.4 将3中混合好的液体加入到过滤柱中。 3.2.5 将4中柱子放置于室温离心机中，2240g离心10min。 3.2.6 将离心柱丢弃，保存离心后的试剂（务必要避光，记录首次混匀的时间，试剂在混合后务必不要超过六周，每次混匀的试剂可以用于5张芯片）。 3.2.7 将试剂保存于4℃冰箱内，避光保存，每次使用前需要将其放于室温30min平衡。务必保持避光。 3.3 芯片制备 3.3.1 将胶混合液及试剂盒内试剂室温平衡30min后进行操作。 3.3.2 取出新的芯片，将芯片固定于芯片槽内，在注胶位置上，加入9μl（注每次加样务必加在管底，不能加在管壁上，且每次加样时将移液器打到第一档即可，防止产生气泡）。 3.3.3 设定计时器60s倒计时，将注胶器上的注射器位置放于1ml处，盖上注胶器（盖严时会听到“当“的一声），将注射器缓慢推下，固定在最低档后开始倒计时60s。 3.3.4 倒计时完成后，从档位处小心取下注射器，默数5s后，缓慢的将注射器上提，至1ml处时停止。 3.3.5 打开芯片制备器，在加胶孔各加入9μl混合胶。 3.3.6 加入Marker，在所有的12个孔（11个样本槽和1个ladder孔）中加入5ul Marker（绿色的盖）。 3.3.7 加入ladder，在Ladder孔中加入1μl Ladder（黄色的盖子）。 3.3.8 加入样本（样本的浓度范围为5-500pg/μl）在样本孔中加入1μl样本，如果样本不足11个，在没有样本的孔中加入1μl 超纯水代替。（注：此步浓度笔者一般采用ng级别）
3.3.9 将制备好的芯片置于芯片混匀仪中，在最大转速下，按下Start，1min后自动完成，在5min内将芯片进行测定。 3.3 芯片检测 3.4.1 打开2100检测仪，点击软件打开页面。 3.4.2 将芯片放于芯片槽内，固定好后，关上机盖。
3.4.3 选择测定程序：选择接头（电脑与2100的嫁接默认为1，如果脱机运行选择demo），电脑与2100连接后会显示online， 选择测试类型（点击analysis，选择High Sensitivity DNA）。
3.4.5 样本详细信息的输入，在芯片位置处进行双击后进行输入。 3.4.6 点击Start开始运行。大约10min后开始出现Ladder，如果15条ladder正常，则运行基本正常。在45min后仪器运行结束，注意仪器运行过程中，请勿操作界面，更不要震动台面。
3.4.7 机器的清洗：仪器运行结束后，将空白的清洗芯片每孔加入9μl超纯水，换下运行结束的芯片，盖上机盖，半小时后取出。 3.4.8 关闭机器，关闭页面，关闭电脑，运行结束。 |
|
|
