【原】百晓生 | 肿瘤的阿喀琉斯之踵

解螺旋 2020-08-27

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在许多肿瘤中，一些重要基因的突变赋予了细胞以强大的致癌能力，如非小细胞癌（NSCLC）的KRAS突变等，但在一些肿瘤中其重要的基因突变不仅是其强大致癌能力的来源，更却是成为了其的阿喀琉斯之踵。

ARID1A是一种SWI/SNF染色质重塑基因，是人类癌症中最常见的突变基因之一，包括肝脏恶性肿瘤。在已建立的肿瘤中纯合或杂合的ARID1A缺失会增加染色质占据，下调转移抑制因子，导致抑制肿瘤的功能丧失，加速了进展和转移，因此广泛认为ARID1A是肿瘤抑制基因，但Sun等也揭示升高的Arid1a通过CYP450介导的氧化应激促进肿瘤起始。

来自日本的HideakiOgiwara等团队则发现了在ARID1A-Deficient（下文简称ARID1A-def）肿瘤中，由于ARID1A的缺失使得GSH代谢成为了其的致命弱点，并阐释了其中的机制，为广大针对ARID1A缺失的肿瘤的靶向药物提供了一个有确切证据的方向。

目前多数的抗肿瘤药物都是针对激酶异常激活突变的，但是只有部分的肿瘤具有这些突变，这限制了这种药物的发展空间，因此针对非激酶基因突变靶向治疗具有更大的发展空间，特别是针对一些影响共性机制的突变。

该研究则是针对ARID1A缺失突变的肿瘤在细胞GSH氧化还原稳态调控机制上造成的损害进行探讨研究，主要论证了：ARID1A-def的肿瘤细胞由于ARID1A转录激活受损，引起SLC7A11低表达，进而导致原料转换体XCT的表达减少，导致GSH合成原料（半胱氨酸）减少，GSH合成代降低，氧化还原稳态不稳定，容易受到GSH代谢途径的抑制剂的影响，因而使得ARID1A的缺失突变成为了其的致命弱点。

首先是筛选出一种对ARID1A-def细胞敏感的抑制剂并验证其的敏感性，这是后续研究的基础，也是研究的切入口。作者使用HCT116细胞系，敲除ARID1A建模，随后使用了300多种抑制剂进行筛选，最终得到了一种特异抑制ARID1A-def的分子PRIMA-1，在对照试验结果验证ARID1A-def的细胞对抑制剂非常敏感。

筛通路，寻求机制上的启示。知道了敏感性后，作者进行了第二次筛选，寻求机制上的启示。作者用PRIMA-1类似物AR-246对ARID1A-def中FC>2的通路进行了富集，并在前5位中发现了2条和凋亡相关的通路，而且2条通路中都存在NOXA的改变，并在模型中进行了q-PCR验证，凋亡标志物caspase和AnnexinV的测定。（注意：NOXA是一种凋亡标志物）这里作者得到了ARID1A-def对抑制剂的敏感性是其所最终诱发的凋亡所造成的联系。

但是其中的原因到底是如何的呢？在药理上，作者找到了第二个启示，APR-246可转化为迈克尔受体亚甲基奎宁环酮（MQ），与GSH或者TrxR的硫酮相结合而降低GSH或者抑制TrxR的活性。

由此作者将APR-246可诱导ARID1A-def细胞凋亡的原因联系到GSH和TrxR主导的氧化稳态方面。（TrxR，硫氧还蛋白还原酶，可以还原半胱氨酸以产生硫氧还蛋白（TXN））

既然提示和TrxR和GSH有关，那ARID1A-def对APR-246敏感是否是由于TrxR活性抑制还是GSH的降低？作者在APR-246浓度梯度下对各自的活性进行了检测，结果提示GSH水平的变化很可能是整个过程的关键。

此外，由于APR-246的MQ同样可以结合p53，因此作者加做了一份实验，在有效剂量下的APR-246，p53的表达并没有改变，排除了p53机制在此中的干扰。

进行到这一步，作者已经Get到了GSH的要点，进而对GSH合成中哪个亚组成分是主要的靶点进行细化研究。GSH作为调控氧化稳态的重要分子，有必要对GSH代谢途径的分子水平进行分析，因而采用基因分析，寻找发生变化的成分。作者对多个分子使用shRNA沉默、相应的抑制剂进行探索，发现了GCLC，GSS，SLC三个敏感的影响GSH水平的细分靶点。进而这里得到的同时得到了一个新的启示ARID1A到GSH合靶点之间的一个桥梁——SLC。

在最后进入桥梁的进一步深入研究前，作者在这侧重研究了GCLC是否是一个具有显著细胞效应的靶标，进一步肯定接下来研究的价值。此研究中作者选用2008+细胞和TOV-细胞，使用Dox诱导的GCLCshRNA进knockdown。

结果发现在-细胞中knockdownGCLC后细胞的存活，GSH水平均下降，ROS水平升高，这些研究指示GCLC是-细胞致死的靶标。此外，在各种抑制剂的诱导下，GCLC的纠正可以纠正各种抑制剂下诱导的细胞效应，说明GCLC是整个作用过程中的最低下游。

接下来，可以进行桥梁的深入研究了。作者得到了ARID1A与GCLC存在联系，因此猜测ARID1A可调控GCLC的转录，其实也受到了基因筛选中的结果SLC的启示。已经知道了def中其对APR-246敏感是由于GSH代谢故障，可是为何在+细胞中却不存在这种故障呢。

这里又进行了一次基因筛选，不同的是上面的是为了对GSH代谢途径的基因情况进行筛选，而这次是为了寻找转录谱改变。在此得到了受累的基因SCL7A11，进一步探索受累的原因，构建ARID1A与SCL7A11之间的桥梁。

作者从ARID1A的亚细胞定位入手，利用ChIP实验得到了其定位在SCL7A11上。由于ARID1A是SWI/SNF的一部分，作者顺便把其他的组分一并进行了定位，发现他们的定位均受到了损伤。

NRF2是一个固定SCL7A11的转录因子。在这里复合体的损伤导致了NFR2介导的SCL7A11的转录受损。作者由此将ARID1A与SCL7A11之间的关系联系了起来。

由此可以更加的确切的描述机制的具体细节。

到这里细胞、分子维度的实验验证就基本完成了，接下来就是组织、动物维度的了。

首先是临床组织验证，总体上比较粗略。在这里作者使用了11组的卵巢癌患者的组织进行免疫组化，4个高表达ARID1A，4个低表达，3个非影响表达的突变，同时进行ARID1A和SCL7A11的表达检测，发现只有存在ARID1A表达的，都存在SCL7A11的表达。

ARID1A与SCL7A11的表达调控get。在体外的动物模型中，作者这里使用的是TOV-细胞和RMG+细胞。其在肿瘤体积、重量、ROS水平和GSH水平进行验证，同样得到一致的结果。

到此为止，整个文章的论证过程，就到此完毕。这这个研究中，有几个其他的亮点：

这里对该机制的多个点进行了抑制，都有效，说明这些点可能都没有代偿途径，是个有效的靶点，具有很大的药物开发价值。这个是前面的研究GCLC是否可作为一个靶点采取的knockdown验证是一样的。只是在检测指标上更加丰富了些，均包括了GSH水平，ROS水平，以及一系列的通路标志物。
发现了一个药物的新作用，起初AR-246这个药物只是用来激活p53，但是在本研究中其通过另外一条通路来抑制肿瘤，而非p53。
在先前的研究中，已经表明GSH的抑制剂可以能够加强细胞的死亡，而本研究证明了在ARID1A-细胞中，其对这种抑制更加的敏感和有效，注意ARID1A缺失这本来是一个致癌的变异，说明这个抑制可以更加有效的针对ARID1A缺失的肿瘤。
另外，文章说到ARID1A缺陷的GSH代谢途径的脆弱性可能通过减少ARID1A缺乏相关的DNA损伤反应而增强。ARID1A是具有DNA双链断裂的修复功能，其的缺陷会导致DSB的积累。由于GSH的缺乏，导致ROS水平升高，进而产生更多的DSB。故而修复缺乏导致的DSB和ROS诱导的DSB以及ROS高水平均可激活JNK通路，上调促凋亡因子NOXA，因而在def中GCLC是一个重要的因子。

缺乏ARID1A蛋白表达的ARID1A突变肿瘤，由于低SLC7A11表达而导致相应的低GSH水平，这种肿瘤对GSH/ GCLC靶向治疗反应良好，故而ARID1A蛋白的免疫组织化学评估将是选择适合GCLC靶向治疗的患者的有用诊断工具。