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【摘要】 目的 通过研究体外培养的人骨肉瘤细胞株Saos-2，MG-63细胞O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methylguanine—DNA methyltransferase; MGMT）基因启动子甲基化状态，分析去甲基化制剂5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine; 5-Aza-CdR）对MGMT基因表达以及对烷化剂药物耐药性的影响，明确MGMT在骨肉瘤中的表达机制及意义。方法 提取人骨肉瘤细胞株Saos-2和MG63细胞基因组DNA，采用甲基化特异性PCR（MSP）检测MGMT基因的甲基化状态，5-Aza-CdR处理体外培养的细胞，采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞用药前后对烷化剂药物的敏感性，并利用蛋白质印迹方法检测MGMT蛋白的表达变化。 结果 正常培养的Saos-2细胞MGMT基因启动子呈甲基化状态，MGMT 蛋白表达微弱；用5-Aza-CdR处理后Saos-2细胞MGMT蛋白表达明显增强，对烷化剂药物的敏感性发生逆转，用药前后细胞生存率差异有统计学意义。正常培养的MG63细胞MGMT基因启动子呈未甲基化状态，5-Aza-CdR处理前后均能表达MGMT蛋白，表达量差异无统计学意义，烷化剂药物的敏感性在5-Aza-CdR用药前后变化其差异无统计学意义。 结论 骨肉瘤细胞的MGMT基因甲基化状态能稳定地反映细胞诱导MGMT蛋白表达的能力，有可能参与肿瘤发病机制，并影响肿瘤组织对烷化剂化疗药物敏感性。 【关键词】 骨肉瘤；O6-甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶；启动子甲基化；5-氮-2’-脱氧胞苷Osteosarcoma; O6-methylguanine-DNA methyltransferase(MGMT);Promoter hypermethylation; 5-aza-2’-deoxycytidine; (5-Aza-CdR) 前言 O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguananine-DNA methyltransferase，MGMT) 是机体一种非常重要的DNA修复蛋白,能够迅速修复环境中烷化剂或烷化剂化疗药物引起的DNA烷基化损伤，一方面MGMT表达缺失是肿瘤发病的机制之一11，另一方面MGMT基因是目前公认的烷化剂化疗药耐药基因12。近年来骨肉瘤治疗的五年存活率大大提高，烷化剂是骨肉瘤中广泛应用的化疗药物之一，但许多患者仍然出现对烷化剂化疗的耐药，导致治疗效果不佳，我们前期研究也证实骨肉瘤组织中MGMT表达是化疗耐药的重要原因1。预测和克服肿瘤细胞对药物耐受是肿瘤治疗急需解决的问题，而MGMT表达机制的研究是解决上述问题的重要基础，同时这一机制的阐明对预防肿瘤发生、肿瘤早期发现和有效治疗都有非常重要的意义。在人类肿瘤中MGMT失活通常是因为其启动子甲基化造成的2,3，然而对于MGMT在骨肉瘤的细胞和分子水平表达机制仍不明确。本研究对两种骨肉瘤细胞株Saos-2，MG-63细胞中MGMT基因启动子甲基化状态进行检测，并检测脱甲基化前后这两种细胞株对烷化剂药物耐药性及MGMT蛋白表达的变化，探讨MGMT在骨肉瘤中的表达机制及其在预测肿瘤组织耐药及个体性化疗中的意义。 1 材料与方法 1.1 细胞系与材料 1.1.1 试剂 F12K、MEM培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司；替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）、5-氮-2’-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）购自美国 Sigma公司，尼莫司汀ACN（nimustine,1-(4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl)methyl-3-(2-chloroethyl)-3-nitrosourea ）购自日本三共株式会社，噻唑蓝（MTT）购自美国 Amersco 公司，基因组DNA提取试剂盒（DNA Extraction kit）购自美国 Promga公司，DNA甲基化修饰试剂盒（EZ DNA Methylation-goldTM kit）购自美国 ZMYO Research公司，Hotstart Taq DNA聚合酶购自日本Takara公司，CpG甲基化酶（MSssI）购自美国 New England Biolabs公司，小鼠抗人MGMT单抗和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠 IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 人骨肉瘤细胞株Saos-2和MG-63细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，分别培养在含10％胎牛血清及双抗的F12K培养基和MEM培养基，于 37 ℃，5％ CO2 、100％湿度培养箱中培养。 1.2 方法 1.2.1 药物配制 TMZ以二甲基亚砜（DMSO）助溶于PBS配制成浓度为5 mg/ml的溶液，5-Aza-CdR、ACNU、MTT分别溶于PBS配制成浓度为100 mmol/L、5 mg/ml和5 mg/ml的溶液。药物配制后均经 0.22 µm 孔径滤膜过滤除菌，分装–20 ℃ 保存。 1.2.2 细胞脱甲基化处理 取处于对数生长期的Saos-2和MG63细胞，加入浓度为 5 µmol/L的5-Aza-CdR，分别在第 1、3、5 天换液，并始终保持5-Aza-CdR初始浓度不变，培养6 d 后换 成常规培养基培养7d，收集细胞分别进行药物敏感性试验、蛋白印迹试验，同时以未加5-Aza-CdR的正常培养细胞作为对照。 1.2.3 基因组DNA提取 用基因组 DNA 提取试剂盒提取培养细胞的基因组DNA，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。0.8％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测提取 DNA的纯度与浓度。 1.2.4 MGMT基因扩增 应用DNA甲基化修饰试剂盒对提取的细胞基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。修饰后，甲基化的胞嘧啶（C）保持不变，而非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶（U） ，并在随后的 PCR 反应中，被 Hotstart Taq DNA 聚合酶读为胸腺嘧啶（T）。参照文献10设计甲基化和未甲基化引物10，其序列见表1，引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。 采用甲基化特异性PCR（MSP）方法，以修饰后的基因组 DNA为模板，选用Hotstart Taq DNA 聚合酶扩增MGMT基因启动子序列。扩增循环参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，各对引物退火温度 45 s， 72 ℃ 60 s，共35个循环；72 ℃ 延伸5 min。以健康人外周血淋巴细胞（hPBL）DNA 作为未甲基化阳性对照，MSssI处理的hPBL DNA作为甲基化阳性对照，蒸馏水代替模板作为阴性对照。反应完毕，取PCR扩增产物行3.0％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，紫外光凝胶成像系统观察结果。结果判定：出现非甲基化条带（U）而未出现甲基化条带（M）判定为未甲基化；出现甲基化条带而未出现非甲基化条带则判定为甲基化。 1.2.5 烷化剂药物敏感性检测 采用 MTT 法。收集5-Aza-CdR处理细胞和正常培养细胞，制成浓度为1 × 105/ml的细胞悬液，加入96孔无菌培养板内（190 µl/孔），孵育24 h，待细胞生长至对数生长期时，将细胞分为3组，分别加入浓度为 125、100、75、50、25、15、10 µg/ml 的 ACNU（ACNU 组）和 50、25、15、10、5、2.5、1 µg/ml 的 TMZ（TMZ组）以及等量的完全培养液（阴性对照组），每孔加药量10 µl，每个浓度设 3 个平行孔。继续培养72h后，应用酶标仪于波长570nm处测定各组细胞的吸光度（A）值，并根据下列公式计算细胞存活率：细胞存活率=药物组平均A 值/阴性对照组平均A 值 × 100％，实验重复3次。采用Excel计算机程序作对数曲线，以细胞存活50％时所对应的药物浓度(IC50值)作为衡量细胞对药物敏感性的指标。实验重复3次。 1.2.6 MGMT mRAN检测 采用蛋白质印迹方法。收集 5-Aza-CdR 处理细胞和正常培养细胞，用含1.0 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂的 RIPA 细胞裂解液[150 mmol/L NaCl、1％ 乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、0.1％ SDS、50 mmol/L Tris，pH7.4]裂解细胞，收集蛋白样品，行15％ SDS-PAGE后，电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参对照。5％脱脂牛奶封闭 1 h，加入小鼠抗人MGMT单抗（1:200）4 ℃孵育过夜，TBST[150 mmol/L NaCl、0.1 ％（v/v）Tween-20、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2 ~ 7.4]洗膜3次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体（1:5000），室温 1 h，ECL 显色，X光片显影。采用Quantity One 软件分析各条带灰度值, 将各目的条带灰度值除以内参照GAPDH 条带灰度值得到一比值，作为该目的蛋白表达量的半定量结果。实验重复3次，取均值做统计学分析。 1.3 统计学分析 全部数据经统SPSS 13.0统计学软件及Microsoft Excel进行处理，两组均数的比较采用单样本t 检验，用药前后的比较采用配对t 检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P＞0.05表示差异有统计学意义。 2结果： 2.1 MGMT 基因的甲基化状态 MSP结果显示，Saos-2细胞MGMT 基因启动子呈甲基化状态，MG-63 细胞MGMT基因启动子呈未甲基化状态。 （图 1）。 2．2 肿瘤细胞株对烷化剂药物ACNU和TMZ敏感性 用MTT方法检测烷化剂药物处理后肿瘤细胞株细胞存活率。以烷化剂药物浓度(ug／m1)为横坐标，相应的细胞存活率为纵坐标，用Excel软件作烷化剂药物处理后细胞存活率曲线图。见图2，Saos-2细胞对ACNU及TMZ的IC50值分别为：62．11ug／ml、17．14ug／ml，MG63细胞对ACNU及TMZ的IC50值分别为：121.25ug／ml、22.12ug／ml，MG-63细胞对两种烷化剂药物的IC50值均大于Saos-2细胞对两种烷化剂药物的IC50值。表明Saos-2细胞比MG-63细胞对两种烷化剂药物敏感。用脱甲基化药物5-Aza-CdR 处理2 种细胞后，MGMT 基 因 启 动子脱甲基化的Saos-2 细胞对烷化剂药物的敏感性发生了逆转，其对 ACNU 和 TMZ 的 IC50 值分别升高了 2 .2和 2.9 倍（均 P ＞ 0.05）；而 MGMT 基因启动子未甲基化的 MG63 细胞对 ACNU 和 TMZ 的敏感性则无明显变化（P ＜ 0.05）。 2.3 5-Aza-CdR处理前后两株骨肉瘤细胞MGMT蛋白表达 蛋白质印迹检测结果如图3所示，MGMT蛋白相对分子质量约为22kDa。内参GAPDH蛋白相对分子量为36kDa。正常培养的Saos-2细胞可见较微弱的MGMT蛋白特异性条带，用5-Aza-CdR处理后则可见MGMT蛋白特异性条带明显增强，灰度分析结果显示，用药前后MGMT与GAPDH比值分别为（0.182±0.017），（0.419±0.026），差异有统计学意义。而正常培养和5-Aza-CdR处理后的MG-63细胞均可见MGMT蛋白特异性条带且二者内参灰度比值无明显变化(P＜0．05)。 3.讨论 MGMT（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）是一种普遍存在的DNA修复酶, 此酶不仅可以修复DNA鸟嘌呤碱基上的甲基化损伤，而且可以修复DNA鸟嘌呤碱基上任何形式的烷基化损伤，能够迅速移除DNA上鸟嘌呤O6位点的能致突变毒性和细胞毒性的烷基化加合物，使损伤的鸟嘌呤恢复，从而能够保护细胞对抗烷化基团的损害，肿瘤组织中存在一定程度的MGMT表达缺失，这可能是肿瘤发生的重要途径，同时MGMT 蛋白在很多肿瘤组织中的表达明显影响烷化剂的治疗效果已被研究证实4,5,6,7。 对其它肿瘤的研究发现，MGMT蛋白表达受其基因启动子CpG岛甲基化调控2,3。DNA甲基化是肿瘤中最常见的分子改变之一，参与恶性肿瘤的发生与发展8。基因启动子区及附近区域CpG岛的DNA甲基化可以在转录水平调节基因的表达，导致抑癌蛋白表达的减少。从而引起相应基因沉默。这些基因包括抑癌基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、MGMT、血管形成抑制基因等,促进细胞恶变。另一方面，MGMT基因过甲基化导致蛋白表达缺失或减弱，增强肿瘤对烷化剂药物敏感性。因此，MGMT基因甲基化在肿瘤早期诊断和预测肿瘤对烷化剂药物敏感性中可能具有重要意义。 骨肉瘤中MGMT蛋白表达与基因启动子CpG岛甲基化之间的关系研究鲜有报道。我们前期研究中在正常组织中没有检测到MGMT基因的甲基化，而在骨肉瘤患者肿瘤组织中MGMT 基因甲基化发生率为23.5％1。本研究进一步证实人骨肉瘤细胞中某些细胞系存在着一定程度的MGMT基因启动子高甲基化和表达减弱，表明DNA修复基因MGMT甲基化是骨肉瘤发生过程中一种早期分子事件，可能是肿瘤发病机制之一，同时我们发现人骨肉瘤细胞系中MGMT 基因甲基化状态与细胞对烷化剂的药物敏感性密切相关。Saos-2细胞株MGMT 基因启动子呈过甲基化状态，蛋白低表达， MG-63细胞株MGMT 基因启动子呈未甲基化状态，则蛋白高表达，两种细胞株对烷化剂药物的IC50值差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，除了具有肿瘤早期诊断价值以外，MGMT基因启动子甲基化状态还可能成为肿瘤烷化剂化疗效果的预测因子。 由于异常甲基化抑制肿瘤相关基因表达的过程是可逆的．因此有可能通过应用去甲基化制剂诱导因甲基化失活的基因重新表达，从而恢复抑癌功能，5-Aza-CdR为一种嘧啶类似物，作用机制是通过与DNA甲基转移酶共价结合，使DNA甲基转移酶的生物活性降低，使CPG岛高甲基化的抑制基因重新表达，恢复抑癌作用。有人将该药物用于白血病的临床治疗9。在实体瘤中的作用尚不清楚，但是不可否认药物本身也可产生抑制作用，如存在细胞毒效应等。有研究表明，细胞毒性作用的药物其细胞毒性效应均存在着时效性，且是非遗传性的。在本研究中，细胞经5-Aza-CdR药物作用6天后，去除培养7天，避免了药物的毒性作用。因此，肿瘤细胞对烷化剂药物敏感性改变能够反映出是5-Aza-CdR去甲基化作用的结果。本研究中，5-Aza-CdR作为去甲基化制剂处理人骨肉瘤细胞株Saos-2后MGMT 蛋白表达明显增强，从反面证实5-Aza-CdR成功逆转Saos-2细胞MGMT 基因的过甲基化状态，通过这一机制调控 MGMT蛋白的表达，这提示MGMT基因甲基化状态能稳定地反映细胞诱导MGMT蛋白表达的能力，而MGMT表达与烷化剂化疗药物敏感性密切相关。我们研究结果也表明在骨肉瘤治疗中，如果应用该药物则同时会降低肿瘤细胞对烷化剂药物的敏感性。因此5-Aza-CdR应用于肿瘤治疗时在考虑其去甲基化后造成抑癌作用的同时还应考虑其导致肿瘤细胞对烷化剂耐药的不利因素，不应与烷化剂药物同时应用。对于其抗肿瘤的实际临床应用可行性仍需要更深入研究。 总之，本研究表明MGMT甲基化可能是骨肉瘤发生过程中一种早期分子事件，MGMT 基因甲基化状态是预测肿瘤组织对烷化剂化疗药物敏感性的分子标记，去甲基化制剂5-Aza-CdR能逆转MGMT基因甲基化恢复其转录活性的作用，然而可以导致肿瘤组织对烷化剂药物的敏感性降低。MGMT蛋白表达及其基因甲基化对于肿瘤的发病及化疗具有完全不同的影响，其意义仍需进一步深入研究。 |
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