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肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，是全球癌症死亡的第二大原因。肝癌肝细胞癌（HCC）是成人中最常见的原发性肝癌。该研究的目的是确定长非编码RNAlncHDAC2在HCC肿瘤发生中的作用。 研究从3个原发性HCC肿瘤组织中分选CD13+ CD133 +细胞（下文称为肝癌干细胞，CSC）和CD13-CD133-细胞（称为非CSC），然后进行转录组微阵列，然后通过northern印迹，球形成和异种移植肿瘤模型等方法进一步评估lncHDAC2的表达和功能确认。 lncHDAC2在HCC肿瘤组织中表达并在肝脏CSC中高表达 通过转录组微阵列分析，鉴定出本次研究所关注的lncHDAC2（基因符号：ENST00000601096），其耗损抑制肿瘤球形成最显著。LncHDAC2，位于人类的9号染色体上，含有两个外显子并包含834个核苷酸。lncHDAC2未显示蛋白质编码潜力。HCC原发性肿瘤组织中LncHDAC2通过原位杂交表达，并通过Northern印迹得到进一步验证（图1）。转录组数据显示的肝CSC中lncHDAC2高表达，在HCC原位癌中肝CSC中lncHDAC2也确实高度表达。HCC原位癌和HCC细胞系同样中高度表达。RNA荧光原位杂交技术和细胞核质分离技术显示lncHDAC2主要位于HCC细胞核中。 图1 LncHDAC2促进肝CSC的自我更新和体内肿瘤增殖 耗尽lncHDAC2的HCC原发性肿瘤细胞用于成球实验，显示lncHDAC2消耗显着抑制球形成（图2A）。成球实验也显示lncHDAC2沉默细胞其自我更新能力的降低（图2B）。在构建lncHDAC2敲除（KO）细胞的动物体内肿瘤增殖实验显示，LncHDAC2KO细胞显着减少肿瘤增殖（图2C）。lncHDAC2敲除肿瘤发生和致瘤细胞频率能力更弱（图2D）。表明lncHDAC2缺失损害肝脏CSC的干性。 图2 LncHDAC2与肝脏CSC中的HDAC2相关 lncHDAC2消耗不影响其附近基因的表达，表明lncHDAC2在反式中发挥其功能。反义RNA纯化（RAP）分析，RNaseH处理筛选针对lncHDAC2转录物的探针，并用地高辛标记。将这些标记的探针与肿瘤细胞球裂解物一起温育，并通过银染色分析（图3A）和质谱分析，鉴定出与lncHDAC2结合的差异带是HDAC2，它是NuRD重塑复合物的主要成分。通过蛋白质印迹（图3B）和RNA免疫沉淀测定（图3C）进一步证实了lncHDAC2与HDAC2的相互作用。通过免疫荧光染色验证lncHDAC2与HDAC2在源自HCC原代细胞的肿瘤细胞球中共定位，并且主要分布在细胞核中（图3D）。通过RNA折叠分析（RNAfolding analysis）预示lncHDAC2外显子1有稳定的茎-环结构。通过结构域作图发现lncHDAC2外显子1（nt1-364）的区域是必需的且足以结合HDAC2（图3E）。LncHDAC2消耗损害了HCC原代细胞的自我更新和肿瘤增殖能力（图2A，C）。然而，在lncHDAC2耗尽的细胞中没有HDAC2结合结构域的突变体lncHDAC2过表达未能挽救表型（图3F，G）。 图3 LncHDAC2将NuRD复合物富集到PTCH1基因的启动子上抑制其表达 lncHDAC2缺失显着抑制Hedgehog（Hh）信号传导（图4A）。通过RNA纯化（ChIRP）测定染色质分离，发现lncHDAC2丰富了转录起始位点上游的PTCH1启动子的1200-1400bp区域（图4B）。通过染色质免疫沉淀（ChIP）测定发现HDAC2也与lncHDAC2相同的PTCH1启动子区域结合（图4C）。通过EMSA验证显示lncHDAC2和HDAC2与PTCH1启动子的相互作用（图4D）。通过交联处理后，ChIP和ChIRP测定显示lncHDAC2与Nurc复合物一起在肿瘤球形细胞裂解物中共洗脱（图4E，F）。通过DNA酶I敏感性测定，显示lncHDAC2或HDAC2缺失显著促进PTCH1启动子的活化（图4G）。荧光素酶报告分析证实了PTCH1被lncHDAC2和HDAC2抑制。研究观察到lncHDAC2和HDAC2能够与PTCH1启动子结合，而无HDAC2结合结构域的lncHDAC2突变体无法与之结合（图4H）。抗HDAC2抗体不在IncHDAC2KO肿瘤球形细胞中的PTCH1启动子区域上富集（图4I）。因此，H4K5和H3K9乙酰化水平提高（图4J）。lncHDAC2在lncHDAC2缺失细胞中的过表达可以挽救表型，而突变体lncHDAC2的过表达失败（图4I，J）。数据表明lncHDAC2将NuRD复合物募集到PTCH1基因的启动子上以抑制其表达。 图4 LncHDAC2介导的PTCH1下调促进Hh信号激活并驱动肝脏CSC的自我更新 PTCH1是一种十二通道转运蛋白样Hedgehog受体，可阻止七跨膜蛋白Smo与Gli转录因子偶联。消除HCC原代细胞和HCC细胞系中的HDAC2和PTCH1，发现PTCH1缺失增强了Smo活性，而通过GloSensorcAMP测定显示lncHDAC2或HDAC2缺失降低了Smo的活性（图5A）。HDAC2缺失促进Gli转录因子GLI2和GLI3的蛋白酶体降解，导致其相应的阻遏形式GLI2R和GLI3R的产生增加。研究显示PTCH1缺失降低了GliR水平，而lncHDAC2或HDAC2缺失增加了GliR水平（图5B）。IHC染色显示GLI2在肝CSC的细胞核中强染。 通过RNA-FISH测定，GLI2与肿瘤球形细胞中的lncHDAC2共定位，表明lncHDAC2激活了Hh信号传导。因此，PTCH1缺失促进Hh信号传导的下游靶基因，而lncHDAC2或HDAC2缺失抑制这些靶基因（图5C）。 使用CRISPR/ Cas9方法删除了HDAC2结合区的PTCH1启动子（PTCH1PKO）。显示PTCH1 PKO细胞可以促进肿瘤球形成和肿瘤传播能力（图5D-F）。在PTCH1PKO细胞中，lncHDAC2消耗对肿瘤球细胞形成和肿瘤传播能力没有影响（图5D-F），表明lncHDAC2介导的肝CSC自我更新的促进依赖于PTCH1表达。使用环巴胺来治疗细胞用于肿瘤球形成测定。我们观察到环巴胺治疗可能损害PTCH1缺失诱导的肿瘤球细胞形成和肿瘤传播能力（图5G-I），表明PTCH1介导的Hh信号传导是肝脏CSC自我更新所必需的。总体而言，lncHDAC2介导的14PTCH1下调促进Hh信号传导激活并驱动肝CSC的自我更新和肿瘤传播。 图5 HDAC2和PTCH1表达水平与HCC严重程度相关 HDAC2在HCC肿瘤中高表达，特别是在具有高转移率肿瘤中（图6A）。同时，HDAC2的表达水平也与HCC严重性正相关（图6B）。此外，通过Western印迹（图6F）和免疫荧光染色（图6G），HDAC2在肿瘤细胞成球实验中高度表达。作为NuRD复合物的组分，HDAC1和CHD3也在HCC和肝脏CSC中高度表达（图6D，F）。此外，具有较高HDAC2表达的HCC患者显示较差的预后（图6C）。最后，HDAC2缺失或抑制显著抑制体外肿瘤成球以及体内肿瘤增殖（图6H，I）这些数据表明HDAC2表达水平与HCC严重程度呈正相关。另外发现PTCH1在HCC患者中表达很差（图6J）。通过用免疫印迹（图6K，M）和免疫组织化学染色（图6L）检查HCC样品和肿瘤球形成来验证该观察结果，表明PTCH1表达水平与HCC严重性呈负相关。 图6 研究实验显示，LncHDAC2在HCC肿瘤和肝脏CSC中高度表达。LncHDAC2促进肝脏CSC的自我更新和肿瘤传播。在肝脏CSC中，lncHDAC2将NuRD复合物募集到PTCH1的启动子上以抑制其表达，从而激活Hedgehog信号传导。此外，HDAC2表达水平与HCC严重程度呈正相关，PTCH1水平与HCC严重程度呈负相关。另外，Smo抑制剂环巴胺显示出损害肝脏CSC的自我更新并抑制肿瘤传播。 因此，该研究结果表明了，lncHDAC2通过激活Hedgehog信号通路促进肝脏CSCs的自我更新和肿瘤的传播。下调lncHDAC2可用于HCC抗肿瘤治疗。
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