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第一章 主流NGS技术（某曼技术）有个秘密， 它对于样本的碱基复杂度有一定要求。 如果文库全部由序列相同的DNA片段（克隆）组成； 或者文库的局部碱基序列一样（如PCR引物、接头、barcode等部位）； 或者所谓的文库就是接头二聚体，或者引物二聚体。 其中碱基序列相同的部位，就是碱基复杂度低的部位。 这些部位NGS测序会出问题。 典型的图谱如下： 这个怪图，是怎么形成的呢？ 第二章 我们从一代测序开始，试图理解它的形成原理。 一代测序的模板DNA不是文库，而是克隆。也就是说，一代测序的“文库”全部由序列相同的DNA片段组成。比如： AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC 尽管有这么多分子，但是每个DNA分子的碱基序列是一样的，是一组克隆，其测序图谱是这样的，就像一个分子一样： 【本文中的碱基序列是随意编制的，与测序图不匹配，仅为帮助理解举例。下同。】 如果模板是两种DNA分子等摩尔混合在一起，比如挑克隆时不小心把旁边的克隆也挑了，两个克隆的DNA被提取在同一个试管里（其实，这种情况我们一般称之为污染），假设其碱基序列是这样的： AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC CATGATCCTAGCTACTACGTACCTAGCATCTATCCTACCA CATGATCCTAGCTACTACGTACCTAGCATCTATCCTACCA CATGATCCTAGCTACTACGTACCTAGCATCTATCCTACCA CATGATCCTAGCTACTACGTACCTAGCATCTATCCTACCA 其测序图谱： 每个位置都是杂合子，除了碰巧有些位置是纯合子以外。 如果模板是3种DNA等摩尔混合（污染）： 如果我们把无数种DNA混合在一起，那场面一定很……其实也不壮观，反而波澜不惊： 注意：这张图的纵坐标换成了%Base。 我觉得，就是保留荧光信号强度，其实也说得通。 第三章 现在翻篇，进入NGS世代。 假设一个文库的前70个碱基序列一模一样，后80个碱基各不一样，测序图谱就是下图这样： 要模拟（构建）这种特殊情况，一点也不难。具体操作流程如下： 所有样本都使用同样序列的引物做PCR， 把PCR产物构建成NGS文库， 然后把这些文库混合在一起进行NGS测序。 假设上游引物的长度是70碱基，你就会得到这样一张图。（图中我把引物写成接头了，汗） 其实，这种劳动我们不称之为构建，称之为——犯错。 如果文库是接头二聚体，看下图： 把read 1和read 2按顺序排列，中间再加上一段7碱基或者9碱基的barcode read，得到下图（为了简化，只显示一种碱基）： 同时展示4种碱基： 第四章 这点内容，大家早就知道了， 不需要这么啰嗦…… ……好吧。 |
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