 “十年磨一剑，砺得梅花香”。2019年，艾吉泰康联合创始人屈武斌在《Nucleic Acids Research》期刊上发表了升级为全面的引物质量评估软件——MFEprimer-3.0版本。自2009年发表的MFEprimer-1.0版本，陆续迭代至今，已历经十年之久。众所周知，引物设计是多重PCR捕获技术的重要环节，艾吉泰康作为MultipSeq®多重PCR捕获技术的研发者，为您讲述引物设计十年技术求索路。 方兴 多重PCR扩增技术的兴起与应用 1988年，Chamberian提出了多重PCR体系的雏形，并将多重PCR首次应用于扩增Duchenne Muscular Dystrophy (DMD)基因[1]。此后，应用于靶序列富集的多重PCR扩增技术及其下游检测技术相辅相成并迅猛发展。不同的检测方法，对应的可同步检测目标数量（或者引物重数）有非常大的差异。常规的凝胶电泳、毛细管电泳、荧光等检测方法，多用于20重以下的快速检测；而结合二代测序技术，可同时检测成千上万的突变（位点/区域等），也即是说，此时的多重PCR需要一个反应管中完成上千对引物的同时扩增。 随着精准医学的发展，其对同时检测多个突变位点、成本集约和速度提升的追求，使得多重PCR捕获技术在精准医学领域的应用越来越广泛，但同时也提出了较高的要求，如检测准确性、稳定性、更大数量的突变检测（引物重数多）等。 道阻 多重PCR扩增技术的困境与突破 相对于单重PCR，多重的突出特点是反应体系中的引物数量多，目前常见的精准医学领域的panel多为数百重（即数百对引物），1000+重也较为常见。引物设计的难题是“众口难调”，即如何保证反应体系中的引物都能在同一个反应环境下有效扩增？ 最为关键的几个引物设计的因素为：
求索 引物设计与质量控制的十年探索路 如上所述，尽管不同的PCR应用（如realtime-PCR，multiplex-PCR，ARMS，数字PCR等），其引物设计软件可能有所不同，但无一例外，在引物设计过程中，都需要进行引物质量评估。因此，无论是学术界还是工业界都需要一个独立的、可靠的引物质量评估软件。这就是屈武斌开发MFEprimer的初衷和坚持。MFEprimer从2009年发布并开放网页端和本地使用至今，历经十年的更新迭代，迄今相关软件文章累计被引频次高达数百次，便利全球引物设计工作者实操使用。 以下为引物设计软件的发展历程，亦可作引物设计逐渐走向标准化和规范化的求索之路： 2009年 2009年，MFEprimer 1.0版本发表于《Bioinfomatics》，是专门针对PCR引物特异性进行评估的软件工具，核心点在基于基因组/转录组水平从多个因素评估PCR引物的特异性情况[2]。 2012年 2012年，MFEprimer升级为2.0版本，采用k-mer算法，极大的提高了特异性分析的速度和灵敏度[3]。 2015年 《PCR Primer Design》（第二版）中专门加入名为《Selecting specific PCR primers with MFEprimer》的一章内容，系统的阐述引物非特异扩增发生的原理及分析的思路和方法[4]。  2019年 MFEprimer-3.0版本发布，除了引物特异性分析之外，还包括了二聚体、发卡结构、结合位点等多因素评价功能，从之前的特异性评估工具升级为全面的引物质量评估工具。新版本软件的稳定性和速度均得到工业级别验证，同时也可作为质量控制模块，灵活嵌入到不同的引物设计流程中[5]。  在开发和迭代的过程中，MFEprimer作为高效的引物质量评估工具，也被整合到具体的应用当中，如： 2010年 屈武斌老师发表的多重PCR引物设计软件MPprimer，整合了MFEprimer作为引物特异性分析的工具，阐述并实现了多重引物设计的思路，并开源了多重引物设计的代码[6]。 2018年 艾吉泰康与华中农业大学谢胜松老师合作的small non-coding RNAs引物设计软件，后台的质量控制程序也正是MFEprimer[7]。 十年，在屈武斌老师及其设计团队对引物设计事业的不断实践探索下，才有了MFEprimer-3.0版本的发布，MFEprimer的更新迭代现已实现了对引物设计的全面质控，将成为引物设计者的得力助手。 前行 艾吉泰康引领多重PCR技术商用拓展之路 艾吉泰康的多重PCR引物设计系统AIdesign-MultipSeq®，从2015年开始应用于实际项目当中，迄今已经四年多了，并且一直在更新迭代。 上文提到最新发表的MFEprimer-3.0实际上也正是从MultipSeq®中归纳了很多共有的元素后，在2.0版本的基础上，共享出来，供学术和产业界使用。2010年，屈武斌开发了MPprimer[6]，一个多重PCR引物设计软件，这个版本更多的是思路的延伸和实践。而从初发表到今天将近十年的时间里，更为重要的是实践和数据的积累。 在艾吉泰康，艾吉泰康联合创始人屈武斌领衔的引物设计专家团队，专注于多重引物软件设计与质量控制，在理论与实践的相互支持下，不断的完善和升级AIdesign-MultipSeq®的流程，助力MultipSeq®多重PCR扩增子捕获技术的创新与应用落地。 目前，艾吉泰康MultipSeq®捕获平台可按特异需求个性化定制Panel，支持多个物种地低至几十高至千余位点的快速设计，并支持自主开放定制和立项共研发等多种服务模式，检测服务产能>15000样/月，致力于提供稳定的、高性价比的多重PCR技术解决方案。 在MultipSeq®的不断前行和探索中，技术的应用边界正在不断被拓展。艾吉泰康在项目和实践中发现，作为最成本优良和经济高效的二代测序捕获方案之一，多重PCR捕获技术早已不仅仅是一种针对临床确定疾病基因热点的快速检测方法。迄今，艾吉泰康MultipSeq®捕获技术已应用于精准医学、大健康、司法鉴定、科研、农业等多领域的实际应用场景中。在这其中，艾吉泰康针对领域高频热点需求和痛点，也陆续开发了一些预定义的商用服务产品和解决方案，如今年4月推出的Y-STR基因检测产品、6月推出的大健康基因检测解决方案等。 “为生命而精准设计”，从认知PCR技术到掌握PCR技术还有很长的一段路，在PCR反应过程中依然有很多未知，但探索基因捕获技术的脚步永不停歇。艾吉泰康将继续保持多重PCR引物设计的优势，不断引领多重PCR新应用的拓展。作为中国质造的、自主创新的、让利于民的先锋级民族品牌企业，艾吉泰康将一以贯之，用技术引领中国基因捕获技术和高通量测序产业发展，为解开生命健康密码而更精准的设计、前行。 1 END 1 参考文献 [1] Chamberlain, J.S., Gibbs, R.A., Ranier, J.E., Nguyen, P.N. and Caskey, C.T. (1988) Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res, 16, 11141-11156. [2] Qu, W., Shen, Z., Zhao, D., Yang, Y. and Zhang, C. (2009) MFEprimer: multiple factor evaluation of the specificity of PCR primers. Bioinformatics, 25, 276-278. [3] Qu, W., Zhou, Y., Zhang, Y., Lu, Y., Wang, X., Zhao, D., Yang, Y. and Zhang, C. (2012) MFEprimer-2.0: a fast thermodynamics-based program for checking PCR primer specificity. Nucleic Acids Res, 40, W205-208. [4] Qu, W. and Zhang, C. (2015) Selecting specific PCR primers with MFEprimer. Methods Mol Biol, 1275, 201-213. [5] Wang, K., Li, H., Xu, Y., Shao, Q., Yi, J., Wang, R., Cai, W., Hang, X., Zhang, C., Cai, H. et al. (2019) MFEprimer-3.0: quality control for PCR primers. Nucleic Acids Research. [6] Shen, Z., Qu, W., Wang, W., Lu, Y., Wu, Y., Li, Z., Hang, X., Wang, X., Zhao, D. and Zhang, C. (2010) MPprimer: a program for reliable multiplex PCR primer design. BMC Bioinformatics, 11, 143. [7] Xie, S., Zhu, Q., Qu, W., Xu, Z., Liu, X., Li, X., Li, S., Ma, W., Miao, Y., Zhang, L. et al. (2018) sRNAPrimerDB: Comprehensive primer design and search web service for small non-coding RNAs. Bioinformatics. 关于艾吉泰康® 艾吉泰康 ( iGeneTech ) 生物科技（北京）有限公司，是坐落于北京市中关村生命科学园的高新技术企业，专注于基因检测上游的目标区域基因捕获技术研发与创新。 艾吉泰康依托液相探针杂交( TargetSeq® )和多重PCR扩增( MultipSeq® )两套自主知识产权的捕获技术，形成了包含基因捕获试剂与试剂盒、捕获服务解决方案、合成生物学的多元化产品体系，致力于不断推进靶向捕获技术在精准医学、科研、大健康、农业、公卫和法医等多场景中的转化与应用。 |
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