噬菌体展示抗体库技术

生物制药合伙人

噬菌体展示技术

1989年分别由英国剑桥的winter研究组和美国加州的Lernerd研究组同时创立了噬茵体抗体库技术，这一重大技术被誉为抗体第三次革命中的革命，从此用丝状噬菌体表面展示技术制备高亲和力特异性抗体成为可能。表面展示系统除丝状噬菌体展示系统外，还包括λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和细菌展示系。

噬菌体展示技术示意图

单链丝状噬菌体展示系统

1．pIII展示系统及噬苗体抗体
　　丝状噬茵体是单链DNA病毒，pIII是病毒的次要外围蛋白(minor coatprotein)、位于病毒颗粒的一端，每个病毒颗粒都有3—5个拷贝pIII蛋白，pIII有两个位点可供外源序列插进，即N端和近N端可伸屈胃内。当抗体片断或蛋白质融合到PIII的N端时，噬菌体仍有感染性，但若融合到后一位点则会切往N端而丧失感染性，这时就需有辅助噬菌体提供野生型pIII蛋白。PIII很轻易为蛋白水解酶水解。所以有辅助噬菌体超感染时．可以使每个噬菌体均匀显示不到一个融合蛋白，即所谓“单价”噬茵体，从而使抗体部分最大限度地保持原构型而功能完好。
  PIII展示系统的主要用途是制备噬茵体抗体，它的突出优点是模拟了自然免疫选择系统。自然免疫系统中．抗原结合于B细胞表面受体而使其活化并分裂增殖、分化成有抗体分泌功能的浆细胞。这个过程可以从约5×10⁹个鼠细胞选出一个至几个特异B细胞，并有选择性地富集特异性B细胞，通过多轮突变和选择使抗体亲和力成熟。pIII展示系统完全模拟了自然选择系统；噬菌体展示的抗体片断可以由抗原包被的板、柱等选择，或者用生物素标记的抗原从液相中捕捉。结合在固相抗原的噬茵体抗体经洗涤后可用可溶性半抗原、酸、碱等洗脱，然后感染大肠杆菌培养扩增，再经下一轮的“吸附—洗脱—扩增”筛选。首轮筛选可使特异性噬菌体富集20一1000倍，一般经4轮筛选，可富集107倍。对初步筛选的抗体，可以用错构酶及PCR锗配技术等实行多轮突变或采用链置换法使其亲和力成熟。
   用PIII系统制备抗体的基本程序是：从经免疫或未免疫者获取淋巴细胞(外周血淋巴细胞，或脾、淋巴结、骨髓等的淋巴细肥)，提取细胞mRNA(或细胞基因组DNA)，逆转录成cDNA，用PCR方法扩增抗体重链和轻链基因，若制备ScFv抗体片断，还需设计接头Linker，如（Gly4—Ser），做成VH—Linker—VL连接)。将扩增的抗体基因克隆到丝状噬茵体载体中，若欲制备ScFv抗体，则克隆VH—Linker—VL基因，若制备Fab抗体、则可将VHCHl基因克隆进λ菌体载体，轻链基因克隆进PASK22类型载体中，在大肠杆菌共表达，或将二者克隆进同一噬茵体载体中进行表达。P III展示系统的载体，在抗体基因与P III蛋白之间插进了一个琥珀中止密码(amber stop codon)，当此密码受抑制时抗体片断就展示在噬菌体表面，当此密码不受抑制时抗体则分泌。因此在抑制型和非抑制型大肠杆菌中培养重组噬菌体时就分别模拟了B细胞表面呈现抗体SmIg和浆细胞分泌抗体的功能。已有用P III展示系统成功地筛选到高亲和力特异性抗体的报道。
　　与杂交瘤技术相比，pIII展示系统筛选范围从几千扩增到几百万甚至几亿．而时间可以从几个月缩短到几周，它不但绕过了繁琐的杂交瘤技术．甚至可以绕过免疫，而且可以直接获取人源性抗体，解决了鼠单抗应用于人体免疫源性题目。
2．pVIII及其它展示系统
pVIII是丝状噬茵体主要衣壳蛋白(major Coat protein)，每个病毒颗粒有3000拷贝pVIII蛋白。pVIII的N端四周可融合五或六肽，但不能融合更长的肽链，由于较大的多聚蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配，使其失往感染力。但有辅助噬茵体参与时，可提供野生型pVIII蛋白．降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片断。

λ噬茵体展示系统

1.pV展示系统
　　λ噬菌体的主要尾部蛋白pV可供外源序列插进。λ噬菌体基因V编码的主要尾部蛋白形成管状结构，由32个盘状结构组成，每个盘状结构又由6个pV亚单位组成。pV有两个折叠区〔fo1ding domain)，C真个折叠区是病毒的非功能区，可供外源序列插进或替换。Maruyama等用pV系统成功地展示了有活性的大分子蛋白：β—半乳糖苷酸(465KD)和植物外源凝集素BPA(120KD)。DNA结合蛋白、放多细胞质蛋白若融合进丝状噬菌体，将相互干扰由细菌细胞质到周质腔分泌的通道，而用λ噬菌体使其在细胞质中完成折叠，无需分泌，因此避免了这一干扰。λ噬菌体还可以展示难以分泌的肽或蛋白质，因此可作为丝状噬菌体展示系统的补充。
2．D蛋白展示系统。
　　D蛋白是λ噬菌体头部组装必须蛋白，分子量11KD。λ噬茵体颗粒的两个结构单位头部和尾部是分别组装的。在头部组装过程中先形成支架状前头，然后水解加工成前头，当DNA进人头部以后，D蛋白附着于病毒衣壳的外侧、将噬茵体头部锁住，使之围绕DNA就位，因此正常情况下，D蛋白在噬茵体头部形态发生上是必须的。但是当噬茵体基因组小于野生型基因组的82％时，它可以在缺少D蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体。这种展示一般为N端展示。它的组装可以在体内，也可以在体外，体外组装即是将D融合蛋白结合到λD—噬菌体表面，而体内组装是将含D融合基因的质粒转化进λD—溶源的E．Coli菌株中从而补偿溶源茵所缺的D蛋白，通过热诱导而被组装，或利用噬菌体P1的Cre—loxP定点重组系统将外源基因整合进进噬茵体基因组中。
　　D蛋白展示系统的特点：由于是在病毒细胞内完成组装．无需将外源肽或蛋白分泌到细菌细胞膜，可以展示对细胞有毒性的蛋白。另外，D蛋白展示系统还可以用于cDNA文库的构建，抗原位点分析及作为基甲输送工具。Mikawa等对D蛋白的基因进行了改造，使外源序列在D蛋白的N端和C端都能插进，并成功地表面展示了有活性的葡萄球菌A蛋白IgG结合域、β—半乳糖昔酶和β—内酰胺酶。

T4噬茵体展示系统

  T4噬菌体展示系统是将外源肽或蛋白质与T4噬菌体的小外衣壳蛋白(small outer capsid protein SOC)C端融合而被展示。如SOC是一个分子量为9KD的小蛋白，是T4衣壳组装非必须的，而且不论在体内还是体外，它都具有与成熟衣壳表面特定位点高亲和力地专一结合的能力，T4噬菌体是在宿主细胞内组装而不必通过分泌途径，因此可以展示的败或蛋白质范围广，尤其适用于展示那些不能被E．coli分泌的复杂蛋白质。
　　目前已成功地利用该系统展示了HIV—1病毒被膜糖蛋白gpl 20的v3环状结构域和脊髓灰质炎病毒VPl衣完蛋白(312肽)，两者均能形成正确的折叠结构。由于该系统容量大(至少35KD的蛋白质)、拷贝数高，故在完整结构域或蛋白质的免疫学展示、蛋白质与蛋白质问相互作用的研究及生物工程学方面有相当大的应用潜力。
　　现在有研究报道利用E.coli的脂蛋白、鞭毛蛋白展示外源蛋白。但是相对而言，革兰氏阳性菌比阴性的有优越性：G 细菌表面受体比G—细菌更易接受外源序列的插进；G—细菌展示系统的表面展示要穿过整个细胞质膜，需要膜上的正确整合过程，而G 细菌展示系统只需穿过单层膜就可以实现理想的展示；以细菌全细胞作为诊断或Panning实验，从巨大文库中筛选特异性细菌克隆的实际操纵中，由于G 细菌有较厚的细胞壁，不轻易在各种实验过程中发生细胞溶解。

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术是近年发展起来的一项新的基因工程抗体技术。它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。    

（一）基本原理和程序    

噬菌体抗体库技术的原理，简言之就是用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，就可以方便地利用抗原-抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，则可获得可溶性的抗体片段。在建库过程中如果将VH和VI。随机组合，则可建成组合抗体文库；如果抗体mRNA来源于未经免疫的正常人，则可以在不需要细胞融合的情况下建立起人天然抗体库。    

构建噬菌体抗体库通常包括以下几个过程：

①从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并反转录为cDNA；

②应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；

③构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有入噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库（surfacedisplayantibody library）常用载体；

④表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲和吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。     

（二）噬菌体抗体库技术的特点   

1．模拟天然全套抗体库  

抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血，骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mmDNA，mmDNA反转录形成cDNA，这些mRNA是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。   

2．避免使用人工免疫和杂交瘤技术  

由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，从而避免了使用人工免疫动物和细胞融合技术。    

3．可获得高亲和力的人源化抗体  在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。