|
继前期文章《全外显子测序在临床诊断中的应用》简单介绍了在临床中应用全外显子组测序（WES）的优势，本期将接着讨论WES在科研中的应用。 基本概念  图片来源：《医学遗传学》[1] 外显子（exon）通常是指基因内的DNA编码序列，并且最终表达为蛋白质。外显子组是指物种基因组中所有外显子区域的总和。人类外显子组包括22,000余个基因，共180,000余个外显子。整个外显子区域长度只有全基因组的1-2%[2]，但是却涵盖了大多数的单基因病致病突变[3]。 目前，NGS应用在临床科研中主要用于寻找疾病在分子层面的发病机制，通过对目标基因的测序来发现新的基因或突变类型，并辅以功能验证或者大样本数据的验证，揭示基因与疾病、基因型与表型之间的关系。 科研潜力 之前很多与遗传病诊断相关的科研文章，由于是借助Panel分析的，大多是关于某一明确致病基因的新的变异类型或者基因型与表型的突变谱的研究，局限性比较强。在一些明确致病基因的回顾性研究中，Panel具有很好的性价比。 但是，在科研的探索之路上，一次性所能得到的信息越多，通过严谨的科研设计和分析，我们就越能揭开疾病最里面的那层面纱。一项产品是否真的适合应用在科学研究中，最重要的就是看它的潜力，在遗传病领域中，这个潜力就是发现新的致病基因。 下面来看下相关潜力分析。  图片来源：OMIN 截止今年7月8号，OMIM中有5582种疾病与基因明确关联，仍然有1560种疾病没有明确基因关联。人类目前一共有20000余个基因，在OMIM中有描述的也只有16112个基因，因此，一次性检测所有基因的外显子区域对于新的致病基因的发现还是非常有意义的。 科研可行性 i. 价格可行性：目前WES的价格已经全面下调，可能对于不同的芯片有相关差价，但是总体价格区间都是在患者或者科研工作者的接受范围内，有助于样本的累积。 ii. 分析可行性：相比于WGS而言，WES只分析位于外显子区域的变异，因此分析更容易。 iii. 解释可行性：由于检测到的变异都位于外显子区域，直接参与到蛋白质合成，因此解释更加容易，相关的验证实验也更方便设计。 具体应用实例 下面我们就用近期发表的一些文章来看看WES在发现新的致病基因等科研发现中的应用。 一、稳妥路线：队列分析 先看今年四月份发表在顶级医学杂志《The New England Journal of Medicine》上的一篇文章。  图片来源：The New England Journal of Medicine 先天性巨结肠是一种肠神经系统发育障碍疾病，是新生儿和婴儿肠梗阻最常见的原因。这类疾病具有80%以上的遗传性，包括一些与肠道神经系统相关的罕见和常见的基因序列变异或者是一些肠神经发育受累及的单基因遗传病或染色体综合征。作者通过对190名患者进行了全外显子组测序以及基因分型，从单核苷酸变异、拷贝数变异到核型变异，来寻找先天性巨结肠的分子学机理[4]，通过WES的检测，在入组患者中一共发现了7个疾病相关的新致病基因。  图片来源：The New England Journal of Medicine 一句话点评 较大的患者群+重点通路富集分析+完善的功能研究+统计学分析，得出患者受益的相关患病风险和遗传咨询依据，环环相扣。 第二篇为2016年发表在《The New England Journal of Medicine》的文章。 作者对患有神经代谢紊乱的47个患儿进行WES测序（其中6例落选、1例退出研究），对得到的41个患儿的WES测序数据进行分析，鉴定出2个新致病基因、22个基因的变异新增相关表型，9个基因的变异的表型与预期一致，并且其中28个患儿已经得到明确诊断，18个患儿已经得到了针对性干预性治疗实验[5]。  图片来源：The New England Journal of Medicine 一句话点评 一定数目的患者群+靠谱的WES分析+完整的临床资料+相关实验层面的验证，辅助新的致病基因的发现，扩大已知致病基因的表型谱，并且辅助临床进行诊断和针对性的干预。 二、运气路线：罕见家系 无需大量样本的累积，只需要单个罕见家系就可以鉴定出新的基因，期待每一位临床医生都能有这样的运气，下面来看实例：  图片来源：Journal of Clinical Medicine 上文发表在《Journal of Clinical Medicine》,IF:5.6。自闭症谱系障碍（ASD）是一组具有高遗传性的神经发育障碍，尽管其潜在的遗传因素仍然没有研究透彻。作者通过全基因组拷贝数变异分析和整个外显子组测序（WES）分析来自撒丁岛的两个ASD兄弟的全面遗传表征，鉴定与该病症相关的新的遗传改变。单核苷酸多态性（SNP）阵列数据揭示了兄弟姐妹中涉及CAPG，ELMOD3和SH2D6基因的罕见微缺失。WES分析导致在受影响的兄弟姐妹中识别VDAC3中罕见的移码突变，这是一种不能丧失功能突变的基因，编码位于PSD上的电压依赖性阴离子通道。此外，在对PSD蛋白的功能变异编码丧失的基因中鉴定出四种错义损伤变体：PLXNA2，KCTD16，ARHGAP21和SLC4A1。该研究将CAPG和VDAC3鉴定为候选基因，并为编码ASD易感性中PSD蛋白的基因提供额外支持证据[6]。 一句话点评 罕见自闭症家系+WES&全基因组拷贝数分析+基因功能研究，单个家系就能找到新的ASD致病基因。 最后来看一篇2016年发表在《The New England Journal of Medicine》上的文章，这篇文章堪称单个家系发现新的致病基因并进行验证的教科书。 来自中美两国学者在新英格兰杂志上联合发布的一篇关于发现阻碍人卵母细胞分裂的新基因TUBB8。该研究先是对一个患有不孕症的超大家系中5名家庭成员进行全外显子检测，包括3名不孕患者。再找到备选基因TUBB8后，对该3名患者及其他家庭成员还有另外23个患病家庭进行Sanger验证。最后通过定量逆转录聚合酶链反应对TUBB8的表达及其同型β-微管蛋白在人类卵母细胞、早期胚胎、精子细胞和一些体细胞组织中进行表达量测定。最后得出TUBB8突变体会导致女性不孕[7]。  图片来源：The New England Journal of Medicine 一句话点评 好的家系经WES筛出可疑致病位点，再通过大样本Sanger验证后对候选基因进行功能验证实验，逻辑缜密，毫无破绽，堪称科研思路模板。 小结 这里给临床医生总结了一些科研的小贴士： 1、遇到高度怀疑遗传导致的疾病，但WES临床报告显示为阴性的报告不要气馁，很可能新的致病基因在万千variants中等你找到它并验证它； 2、单个家系直接找到新基因太考验运气，不如试试多积累些样本进行队列分析； 3、如果你的样本在做了WES和CMA（CNV-seq亦可）后仍未发现有意义的突变，可以尝试WGS或者三代测序； 4、一些特殊类型的突变，如动态突变（脆X综合征）、存在高度同源性的假基因的疾病（先天性肾上腺皮质增生）等，是不适用于NGS测序的，要选择对应的检测方法才能正确检出； 5、当常规NGS遇到瓶颈的时候，有可能跟表观遗传学相关，一些甲基化芯片或者甲基化NGS等也是不错的选择； 6、科研需趁早，也许今年20个样本就能发3分，到明年想发3分就要50个样本了，攒样复攒样，不如分秒必争多收集相关疾病样本进行研究。 最后祝各位临床医生投稿必中，中必高分！ 参考文献 [1] 《医学遗传学》邬玲仟，张学主编. —北京：人民卫生出版社，2016. [2] Alison M. M., Morad A., David R F., Martin S. T., Variant detection sensitivity and biases in whole genome and exome sequencing.,BMC Bioinfomatics 2014, 15:247. [3] Cooper DN, Krawczak M, Antonarakis S. In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 7th edn. 1995:259-291. [4] Tilghman JM, et al., Molecular Genetic Anatomy and Risk Profile of Hirschsprung’s Disease. N Engl J Med. 2019 Apr 11;380(15):1421-1432. doi: 10.1056/NEJMoa1706594. [5] Maja Tarailo-Graovac et al., Exome Sequencing and the Management of Neurometabolic Disorders., N Engl J Med. 2016 June 9; 374(23): 2246–2255. doi:10.1056/NEJMoa1515792. [6] Elena Bacchelli, et al., Analysis of a Sardinian Multiplex Family with Autism Spectrum Disorder Points to Post-Synaptic Density Gene Variants and Identifies CAPG as a Functionally Relevant Candidate Gene., J. Clin. Med. 2019, 8, 212; doi:10.3390/jcm8020212. [7] Ruizhi Feng, et al., Mutations in TUBB8 and Human Oocyte Meiotic Arrest., N Engl J Med 2016;374:223-32. DOI: 10.1056/NEJMoa1510791. |
|
|
