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1 简介 CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA介导Cas9核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。Cas9 的核酸酶剪切活性取决于两个结构域：RuvC和HNH。当这两个结构域同时处于失活状态时(D10A＆H840A：RuvC-＆HNH-)，Cas9将不具有核酸酶活性，成为dCas9(dead Cas9)。CRISPR-dCas9系统即是dCas9与转录激活因子（如VP64）或转录抑制因子（如KRAB）融合后，结合sgRNA能促进或抑制目的基因的表达。 相关研究表明除了转录激活因子VP64与dCas9融合能够提高转录水平以外，三种基于CRISPR-dCas9的转录激活系统（VPR, SAM和SunTag）在动物细胞中也能提高目的基因表达，并且效果更好应用更广泛。 CRISPR-dCas9系统是通过激活或抑制细胞内源基因表达来提高或抑制目标基因的表达量，它不需要转入外源DNA，操作更简易。此系统可在同一个启动子上设计多个sgRNA来提高或抑制基因的转录活性，目的基因的转录本也会覆盖的更全面。当前利用CRISPR-dCas9系统调控内源基因的转录激活，可以用于诱导干细胞的分化、激活沉默基因、遗传缺陷补偿等；CRISPR-dCas9系统调控内源基因的转录抑制，可以用于分析代谢途径、敲低特定基因转录量以研究基因功能等。 图1. CRISPR-dCas9系统调控内源基因的转录激活与抑制（Gilbert Let al., Cell, 2013） 1 应用 CRISPR-dCas9转录激活：可实现目的基因在内源环境中过表达、诱导iPSC等； CRISPR-dCas9转录抑制：可实现抑制目的基因表达，可与CRISPR-Cas9 Gene Knockout或RNAi技术联合作用。 1 技术优势 1. 操作简易：仅需dCas9核酸酶、sgRNA和转录激活因子（如VP64）或转录抑制因子（如KRAB），即可调控目的基因的转录水平； 2. 基因调控是可逆的：与常规转基因技术相比，不需导入外源DNA，不会永久性的修饰基因组DNA； 3. 广谱性：无物种限制、无细胞种类限制； 4. 提供多种基因编辑病毒工具：AAV、LV； 5. 提供 BSL-1 和 BSL-2 病毒注射及实验操作平台； 6. 全面的实验技术支持。 1 服务内容 1. sgRNA的设计； 2. 细胞内sgRNA剪切活性检测； 3. 依据不同需求选择不同载体的构建： a、CRISPR-dCas9转录激活载体的构建：sgRNA-dCas9-VP64/VPR表达质粒 b、CRISPR-dCas9转录抑制载体的构建：sgRNA-dCas9-KRAB表达质粒 4. 依据所要编辑的细胞选择不同导入方式： a、脂质体易转染细胞：使用质粒系统 b、脂质体难转染细胞：使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染 5. RT-PCR检测目的基因的转录水平。 服务流程 1 客户提供 1、目的基因基因序列（序列/ID）以及物种来源 2、需介导转录激活或抑制的细胞（可选） 3、病毒类型选择以及要求 4、血清型选择 服务信息及最终交付内容、产品
声明：枢密科技提供的所有基因编辑服务及该服务的后续研究，仅适用在国家法律和伦理规范的范围内实施。禁止用于任何人体或临床实验的研究；禁止用于对人类生殖体系进行基因修饰的研究；禁止将基因修饰的其他动物胚胎及生殖细胞植入人体。客户如违反相关法律规定，本公司不承担任何法律责任。 1 案例展示 1. Mohammad等人通过比较Tet-on调控dCas9-KRAB的基因敲低（CRISPRi）与Tet-on调控Cas9的基因敲除（CRISPRn）发现CRISPRi对NANOG的抑制效果更快且更完全。主要是由于CRISPRn的敲除存在很大的效率问题，在iPS细胞系中NANOG有抑制的仅60%–70%的细胞，而CRISPRi能达到99%以上。 图2. 基因敲低（CRISPRi）和基因敲除（CRISPRn）效率的比较（Mohammad et al., cell stem cell, 2016, modified） 2. Alejandro等人将dCas9与三种激活因子VP64-P65-Rta（VPR，VP64：疱疹病毒转录因子，P65：NFкB信号通路的成员，Rta：EB病毒激活因子）融合，通过特异性靶向目的基因的sgRNA能特异性的提高内源性基因（MIAT, NEUROD1, ASCL1和RHOXF2）的转录水平，起到激活基因的目的。与dCas9-VP64相比效果更佳显著。 图3. dCas9-VPR能显著提高内源性基因的表达（Chavez et al., Nature methods, 2015） 参考文献 [1] Gilbert L, Larson M, Morsut L, et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 2013, 154(2):442-451. [2] Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 2015, 12(4):326-328. [3] Mandegar, M.A., Huebsch, N., Frolov, E.B., Shin, E., Truong, A., Olvera, M.P., Chan, A.H., Miyaoka, Y., Holmes, K., Spencer, C.I., et al. CRISPR interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell stem cell. 2016; 18, 541-553. [4] Chavez, A., Scheiman, J., Vora, S., Pruitt, B.W., Tuttle, M., E, P.R.I., Lin, S., Kiani, S., Guzman, C.D., Wiegand, D.J., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature methods. 2015; 12, 326-328. |
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