|
要想底气十足地秀出你的WB实验结果，单单内参对照就是一门学问。在对靶蛋白进行分析时，首先考虑是否等量上样，其次考虑信号是否属于检测的线性范围。那么，内参蛋白就尤为重要！ 通常，第一感觉内参蛋白就是 β-actin 或 GAPDH 等。实际上，可以选择的内参有很多，而选择内参有一定的标准。第一，实验条件不能改变内参蛋白上样量（点击查看 实验条件对经典内参的影响）。第二，对照内参的分子量必须与靶蛋白不同。第三，也是最重要的一点，检测到的内参蛋白和靶蛋白的信号必须在一个线性范围内，否则你会发现你的条带无法进行定量。 然而，实际操作中，很多同学没有意识到上述的第三个标准。他们认为，印迹上的内参蛋白数量与细胞数量成正比，但这可能是错误性的假设而已，特别是使用单个内参蛋白对多种 WB 实验进行标准化时 (1)。实际上，没有一种内参蛋白能同时满足以上3 点标准，又适用于你各种不同靶点的实验。通常内参蛋白远比靶蛋白丰富得多。在同一稀释度下，测定内参和靶蛋白时，内参蛋白的信号可能较为饱和，甚至会超过检测线性动态范围，这就导致不能报告出泳道之间的差异。 接下来，举两则案例，让你了解信号饱和对条带、实验的影响。 案例一 如图1，过量上样或蛋白含量过高会导致条带残缺，或“呈燃尽状”/“凹陷状”的条带，而不是有序条带，这表明 HRP 偶联二抗已耗尽化学发光试剂。这种情况下，可能还伴随着膜上有褐色斑点，这是过氧化物酶过度活化的一种副产物。 图1. 你的内参蛋白有没有显出这模样？ 如果你的膜上没有出现上述的“怪异”条带或褐色斑点，这也不能说明你的内参蛋白在靶蛋白的线性范围内。即使内参条带看起来较为有序，但仍然可能是饱和的 (2)。所以为了证明内参蛋白和靶蛋白的线性，在同一 WB 实验中梯度上样一系列样品稀释液，或同时转移多个印记以避免转移效率变化 (2, 3)，对蛋白上样量、一抗和/或化学发光试剂可进行滴定测试。 案例二： 下面的例子显示需要更长和更短曝光才能分别获得 HNF1 和 GAPDH 的线性信号。这说明在该情况下，GAPDH和HNF1的信号不在一个线性范围内。 当然 WB 的信号也与检测方法紧密相关。与胶片相比，使用电荷耦合器件 (CCD) 相机检测增强型化学发光 (ECL) 可产生出色的线性动态范围。如果数字信号饱和，则可以使用软件设置来显示红色像素。经证实，荧光扫描（使用与荧光染料而不是过氧化物酶偶联的二抗）可避免发光化学的固有限制，因而更好。所以在设置实验时，采用这些方法可能意味着更少的梯度稀释次数。但如果你的实验室无法使用最新最好的技术，你也可以使用传统 ECL 和胶片获得较好的数据，但需要你花时间设置实验，解决等量上样和动态范围问题。 既往还有文献推荐在做实验前，最好考虑使用 5 个内参蛋白 (2, 3)，这有助于你发现至少一个（好的时候多个）在靶蛋白线性范围内的内参，但使用多个内参蛋白存在耗费时间、试剂的问题，特别是样品珍贵的情况下。所以相对可行的是测定每个样品泳道中的总蛋白上样量，无需探测多个内参蛋白。对每个泳道 (1) 的所有蛋白条带或多个离散条带 (3) 进行染色和扫描，同时还要确保染色剂不会干扰后续的免疫检测。 对于许多研究生和博士后，可能会觉得进行 WB 实验是“常规程序”。但也不要忘了，解释实验的数据时，细节决定成败。仔细考虑样品制备、转移条件和一抗等问题，将帮助你避免出现失误 (2, 4-5)。到了文章发表的时候，记得提供所有详细信息，以便其他人准确评估结果并重复做出实验。这才是负责地进行 WB 实验嘛！ 【参考文献】
|
|
|
