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作者：罗聪 陶宁 来源：国际肿瘤学杂志, 2017,44(05) : 369-372. 摘要 化疗耐药是临床难题，研究发现某些蒽环类化合物和奥沙利铂等化疗药物不仅诱导肿瘤细胞凋亡，而且可以引起免疫原性细胞死亡(ICD)，通过诱导肿瘤细胞自噬，释放3类信号：钙网蛋白暴露在细胞表面，刺激树突状细胞(DC)吞噬；三磷酸腺苷释放，招募DC进入肿瘤灶；高迁徙率族蛋白B1促进DC与垂死肿瘤细胞形成稳定结合，诱导机体产生特异性的T细胞抗肿瘤免疫。深入理解化疗诱导的ICD，对于完善化疗方案具有重要意义。 化疗抵抗限制了化疗疗效，对于复发患者往往束手无策。近年来，抗肿瘤免疫取得了较大进展，人们逐步认识到抗肿瘤免疫的重要性，免疫治疗如PD-1抗体、嵌合抗原受体疗法(CART)等有望成为第4种肿瘤治疗方法，免疫治疗更是被Science评为2013年年度重大科学突破[1]。然而CART目前主要是针对B淋巴细胞白血病，PD-1抗体也只是对部分肿瘤有效，尚存在一定的局限性，特别是肿瘤负荷过重的患者。化疗在解除肿瘤负荷方面具有一定优势，而抗肿瘤免疫因为T细胞受体多样性带来的高度适应性对于解决耐药问题具有独特优势，那么化疗与抗肿瘤免疫之间是否有协同作用，是一个受到高度关注的问题。 1 某些化疗药物发挥作用与免疫效应 传统观念认为化疗通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞生长旺盛，相对于一般组织细胞而言，肿瘤细胞往往需要摄取更多的物质供应其生长，因此，更多的化疗药物进入肿瘤细胞，发挥杀伤效应，这是化疗药物差异杀伤的基础。该观点的一个重要证据是同样生长旺盛的组织细胞会产生较大的毒性作用，例如头发毛囊细胞、胃肠道上皮细胞、造血器官，因此化疗药物常见的不良反应包括脱发、呕吐、骨髓细胞受损，特别是后者，将导致贫血及免疫细胞减少等严重不良反应。然而，多项研究表明，化疗抗肿瘤需要免疫系统参与，而且一旦诱发了肿瘤免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death，ICD)后，肿瘤内细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)/Treg的比例上升，患者预后良好，反之亦然，目前的研究数据集中于乳腺癌和结肠癌[2,3,4,5]；Meta分析显示，实体瘤化疗后，淋巴细胞严重减少者预后不良；动物荷瘤实验(包括移植瘤和化学物诱导原发瘤)结果显示，化疗效果在野生型与免疫缺陷型小鼠组间差异有统计学意义[6,7]。 2 T细胞免疫与化疗起效 有研究发现，使用化疗药物(环磷酰胺)后，小鼠肿瘤消退，而采用CD4抗体、CD8抗体或CD3抗体清除小鼠体内的T细胞，小鼠肿瘤生长速度与未使用化疗药物的对照组小鼠没有区别。另外，在缺乏T细胞的裸鼠中使用化疗药物，同样无法抑制肿瘤的生长，而在野生型小鼠中使用同等剂量的化疗药物，肿瘤有明显的消退，充分说明化疗需要机体T细胞的参与。采用干扰素(interferon，IFN)-γ受体基因敲除小鼠进行上述实验发现，使用化疗药物无法抑制肿瘤生长，说明IFN-γ参与T细胞抗肿瘤效应。 3 某些化疗药物诱导ICD与特异性抗肿瘤免疫 3.1 ICD发生的必需条件 ICD的发生需要两个条件[8]：①在体外，肿瘤细胞可被ICD诱导剂(化疗药)杀死，并且在没有任何佐剂的条件下，该肿瘤细胞可引发免疫反应，并保护小鼠在随后注射活的肿瘤细胞时产生保护性的免疫反应，不成瘤或者肿瘤更小；②在体内，ICD可激发局部免疫反应，并招募初始免疫效应细胞进入局部癌灶，并抑制肿瘤生长，且这种抑制效应依赖(至少部分依赖)免疫系统。通过基因敲除或者抗体中和试验，发现参与ICD的免疫系统成分包括Casp1[8]、CXCR3、IFN-γR、IFN-γR1、白细胞介素(IL)-1R、IL-17、Toll样受体(TLR)4、Ly96(TLR4适配体)、Myd88(TLR4适配体)、Nlrp3、P2rx7(嘌呤受体)、Prf1(穿孔素)。此外，裸鼠实验和重症联合免疫缺陷小鼠实验证明免疫系统对于ICD具有重要意义，在这两种小鼠中化疗药不能诱导肿瘤细胞产生疫苗样反应，而且化疗药抗肿瘤效果为无效。 3.2 ICD与病毒诱导免疫反应的类似之处 研究发现，蒽环类化疗药通过激活肿瘤细胞TLR3引起Ⅰ型IFN的快速产生。通过与肿瘤细胞的IFN-α和IFN-β受体(IFNAR)结合，Ⅰ型IFN可以通过自分泌和旁分泌的方式引起趋化因子(CXCL)10的释放。若肿瘤缺乏TLR3或IFNAR，那么将导致化疗失败，若人为补充Ⅰ型IFN或CXCL10，则化疗重新起效。而且，在乳腺癌预后不佳的几项相互独立的队列研究中发现，Ⅰ型IFN相关信号可以预测蒽环类化疗药的治疗效果。该研究还提示蒽环类化疗药介导的免疫反应模拟了病毒引起的免疫反应，研究者认为这种'病毒模拟'的现象可以作为化疗有效的一种标志[9]。 3.3 高迁徙率族蛋白B1与TLR4结合与诱导肿瘤特异性T细胞激活 研究发现放化疗引起肿瘤细胞死亡，后者释放出高迁徙率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)，该分子是一种晚期炎症介质，可发挥预警作用，通过树突状细胞(DC)的TLR4受体及MyD88信号通路引起肿瘤特异性T细胞激活，发挥免疫杀伤效应。在乳腺癌小鼠模型中，HMGB1－/－、TLR4－/－、MyD88－/－小鼠体内，放化疗的抗肿瘤效应都将减弱，同时在流行病学调查中发现，高加索人中有8%～10%携带Asp299Gly，携带该基因型别的乳腺癌个体对放化疗的效果弱于普通人群。研究发现该型别的TLR4会降低HMGB1与TLR4的相互作用，而且会阻断死亡黑色素瘤细胞通过DC激活Mart1特异性-HLA-A2限制性-CTL，因为该激活过程依赖HMGB1作用于DC。研究者认为放化疗诱导的抗肿瘤免疫的形成需要两个关键点，即死亡肿瘤细胞发出两个信号：钙网蛋白(calreticulin，CRT)的暴露('吞噬我'的信号)和HMGB1释放('危险'信号)，进而引起DC对抗原的摄取及TLR4依赖的抗原呈递，两个信号缺一不可。 3.4 化疗药物诱导ICD过程中的自噬 研究者发现化疗药物引起肿瘤细胞发生ICD过程中，自噬发挥重要作用。一般情况下，肿瘤细胞并不发生自噬，而化疗药可导致肿瘤细胞发生自噬，垂死的肿瘤细胞释放出三磷酸腺苷(ATP)，相当于'发现我'的信号，招募DC和T细胞进入肿瘤局部，引起肿瘤细胞发生ICD。若采用自噬抑制剂，可抑制垂死的肿瘤细胞释放ATP，在自噬缺陷肿瘤细胞株中，抑制细胞外ATP降解酶，提高胞外ATP浓度，可重新招募免疫细胞，恢复化疗药的治疗效果[7]。 3.5 甲酰肽受体1与DC成熟 肿瘤内的DC驱动的抗肿瘤免疫有助于蒽环类药物的抗肿瘤效果，DC与肿瘤细胞的接触与甲酰肽受体1(formyl peptide receptor 1，FPR1)有关。 研究者对两项独立乳腺癌队列研究中患者的DNA进行测序，候选单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms，SNP)数目为328个，测定每个SNP位点与基于蒽环类药物的联合化疗总生存期(overall survival，OS)的相关性，鉴定出一个无功能的FPR1等位基因型rs867228，它位于FPR1第2外显子(1037A>C)。rs867228引起1个氨基酸的替换(Glu346Ala)，抑制FPR1信号，rs867228携带者(FPR1CC)与非携带者相比(FPR1CA/FPR1AA)，OS和无转移生存期均缩短。针对结直肠癌的研究也观察到类似现象。 在携带TLR4无功能等位基因型(rs4986790，Asp299Gly)或TLR3无功能等位基因型(rs37755291，Leu412Phe)个体中，rs867228的效应消失，携带正常TLR3/TLR4的乳腺癌患者中，rs867228的负面效应才显效，提示FPR1参与的治疗相关通路与这两个TLR相同。 髓系细胞和某些肿瘤细胞均表达FPR1，研究者构建了不同的实验模型，MCA205纤维肉瘤不表达FPR1，并不影响米托蒽醌和多柔比星的治疗效果，TC-1肺癌也是类似结果，然而若受者小鼠FPR1缺陷，上述化疗药物失效，提示对于基于蒽环类化疗药物而言，FPR1表达在受体小鼠细胞上是必需的，而肿瘤细胞是否表达并不重要。 研究者通过骨髓嵌合实验进一步研究了FPR1如何影响抗垂死肿瘤细胞的免疫反应，野生型小鼠移植了FPR1缺陷小鼠的骨髓，蒽环类化疗药处理MCA205后接种该小鼠，不能激发有效的抗肿瘤免疫反应，而且该小鼠荷瘤MCA205后，基于蒽环类药物的联合化疗无效；反之，FPR1－/－的小鼠移植了野生型小鼠的骨髓后，肿瘤对基于蒽环类的联合化疗反应正常，因此宿主免疫系统表达FPR1是化疗起效的重要前提。 对FPR1的4个配体进行研究，分别是组织蛋白酶A、序列相似19[趋化因子(C-C基序)样]家族成员A4、细菌和线粒体中的N-甲醛化肽和膜联蛋白A1(annexin A1，ANXA1)。通过基因敲除及抗体中和试验，发现ANXA1是其化疗相关的功能配体，两种蒽环类药物(米托蒽醌、多柔比星)均能刺激肿瘤细胞分泌ANXA1。基因芯片检测结果显示，野生型小鼠与FPR1－/－小鼠接受化疗2 d后相比，以下效应的相关基因发生明显改变：①1型IFN反应；②DC成熟、抗原处理及呈递；③细胞毒T细胞效应功能。FPR1表达于瘤内CD45＋的白细胞(CD45－细胞不表达)，尤其是Ly6ChighLy6G－，体外实验显示，FPR1的表达升高于骨髓来源DC与垂死肿瘤细胞接触时，与活肿瘤细胞接触则没有此现象，提示Ly6ChighLy6G－髓系细胞表达FPR1是非常重要的，它们包括DC及其前体细胞。肿瘤细胞缺失ANXA1或宿主细胞缺失FPR1不影响化疗药导致的肿瘤细胞自噬、凋亡和坏死。宿主FPR1缺失也不影响化疗后肿瘤中CD11c＋CD86＋DC、巨噬细胞和中性粒细胞的浸润。研究者在体外用微流道装置证明，FPR1缺陷会导致DC向垂死的肿瘤细胞迁徙。小鼠脾细胞或人的外周血单核细胞(FPR1CC)可表达正常功能的FPR1，用蒽环类化疗药处理野生型肿瘤细胞，它们会向垂死或死亡的肿瘤细胞迁徙，活的肿瘤细胞则无此现象，并且细胞间有超过60 min的接触，反之，FPR1缺陷细胞(来自于FPR1－/－小鼠，人的细胞型别为FPR1CA或FPR1AA)，不存在如此长时间的相互作用，而且DC和垂死或死亡的Anxa－/－肿瘤细胞之间也不能形成稳定的接触。FPR1和ANXA1对于化疗引起的抗肿瘤免疫反应具有重要作用，并不影响炎症DC(CD11C＋CD86＋Ly6Chigh)被招募到肿瘤局部，但它关系到DC靠近垂死的肿瘤细胞，建立稳定的接触，摄取肿瘤相关抗原，并呈递给T细胞。由此可见，FPR1在化疗诱导的抗肿瘤免疫中起着重要作用[10]。 3.6 作用机制小结 化疗药物作用于肿瘤细胞，导致其凋亡，分为3个时间段。凋亡前阶段：内质网应激导致CRT暴露，CRT与CD91结合，刺激DC吞噬肿瘤抗原；凋亡起泡阶段：化疗药通过肿瘤细胞表面的TLR3引起肿瘤细胞发生自噬，垂死的肿瘤细胞释放ATP，ATP与P2rx7结合，招募DC进入肿瘤灶；凋亡后坏死阶段：细胞崩解，HMGB1释放，与TLR4结合，激活信号通路(MyD88)，DC通过其表面的FPR1与肿瘤细胞表面的ANXA1形成细胞间的稳定结合，诱导DC成熟，DC进行抗原摄取，并呈递给T细胞。 DC与T细胞的作用包括两个方面：DC直接作用于CTL；DC通过分泌IL-1β，作用于γδT细胞，分泌IL-17，再作用于CTL。CTL分泌IFN-γ，导致治疗抵抗的肿瘤细胞发生ICD。此外，在此过程中还有Ⅰ型IFN的产生，Ⅰ型IFN可以通过自分泌和旁分泌的方式作用于肿瘤细胞的IFNAR(IFN-α受体和IFN-β受体)，使其分泌CXCL10。 3.7 ICD与T细胞产生的IFN-γ 关于IFN-γ的抗肿瘤效应，有研究发现，T细胞分泌的IFN-γ作用于肿瘤相关成纤维细胞(CAF)，导致CAF分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)减少，通过DLL4和Notch信号通路导致肿瘤局部的血管新生受阻，肿瘤供血发生障碍而导致肿瘤消退[11]。 3.8 ICD对临床的参考 化疗药诱导ICD将产生特异性T细胞抗肿瘤免疫反应，对于解除肿瘤化疗抵抗及清除残存肿瘤细胞具有重要作用[12,13]。不是所有的细胞毒化疗药物都会诱导机体对肿瘤细胞的免疫性杀伤，例如依托泊苷和丝裂霉素C就没有这种效应，目前筛选到的具有ICD效应的是3种蒽环类化合物和1种铂类药物(奥沙利铂)。化疗药诱导肿瘤细胞分泌Ⅰ型IFN，类似于病毒感染的状态，这种良好的反应性可作为化疗有效的指标之一。与之有关联的一个现象是溶瘤病毒也是通过ICD发挥抗肿瘤效应[14,15]，溶瘤病毒在引起细胞崩解的过程中，诱发了特异性的抗肿瘤T细胞免疫[16,17]。提高肿瘤局部ATP浓度，可能有助于招募免疫细胞，提高化疗药的治疗效果。FPR1的SNP位点rs867228可作为乳腺癌、结直肠癌化疗预后不良的一个预测指标。在1 040种美国食品和药物管理局(FDA)批准的药物中，强心苷辅助ICD的效应最强[18]，以往临床上已有报道，只是当时机制不明，随着ICD效应的逐步揭示，强心苷可以作为临床化疗药辅助用药的参考。 |
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