抗中性粒细胞胞浆抗体检测的临床应用专家共识

angelzhang69 2019-08-20

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作者：中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会

抗中性粒细胞胞浆抗体(anti－neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)是以中性粒细胞及单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体。1982年Davies等^[¹^]在节段性坏死性肾小球肾炎的患者血清中发现了ANCA，1985年van der Woude等^[²^]发现在肉芽肿性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis,GPA)患者中出现胞浆型ANCA(cytoplasmic ANCA, cANCA)，1988年Falk和Jennette[3]报道在系统性血管炎和原发性坏死性新月体型肾小球肾炎患者的血清中发现核周型ANCA(perinuclearANCA, pANCA)。随后，研究者使用ELISA发现髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)是pANCA的主要靶抗原，蛋白酶3(proteinase 3, PR3)确认为GPA患者cANCA的主要靶抗原^[³^,⁴^,⁵^,⁶^]。ANCA靶抗原除常见的MPO和PR3外，还包括人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte elastase,HLE)、乳铁蛋白(lactoferrin, LF)、溶酶体(lysozyme,LYS)、组织蛋白酶G(cathepsin G, Cath G)和杀菌/通透性增高蛋白(bactericidal/permeabilityincreasing protein, BPI)等。ANCA作为小血管炎的生物学标志物，主要存在于ANCA相关血管炎(ANCA－associatedvasculitis, AAV)患者中，如显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis,MPA)、GPA及嗜酸性肉芽肿性多血管炎(eosinophilicgranulomatosis with polyangiitis, EGPA)，也可存在于炎症性肠病、自身免疫性肝病等其他自身免疫病，以及恶性疾病、感染性疾病及药物诱导性血管炎等。临床实验室检测ANCA及其特异性自身抗体，对相关疾病的诊断、鉴别诊断、分型、病情监测及预后判断等具有重要的临床意义^[⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^]。

目前，国内尚缺乏ANCA检测的临床应用共识供临床及实验室遵循。因此，中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会于2017年9月组织了国内临床实验室、风湿免疫科、肾内科、健康体检及第三方检测实验室等多学科专家召开本共识的启动会。根据启动会提出的要求，由8位专家依据国内外相关文献并结合国内实际情况及ANCA检测临床经验分别独立起草共识草案，随后对草案进行讨论汇总形成共识初稿。共识初稿经召开专家讨论会由所有专家组成员逐条审议讨论，达成一致意见后形成本共识。本共识的制定，旨在提高我国临床实验室对ANCA检测的临床应用范围、临床意义解读等方面的认识水平，规范我国ANCA检测方法、检测程序、荧光模型判读及结果报告，最终为临床提供规范可靠的ANCA检测报告，以及临床意义的正确理解和合理解释。

一、ANCA检测的临床应用范围

ANCA作为小血管炎的生物学标志物，主要存在于AAV，如MPA、GPA及EGPA。临床上通常对疑似AAV患者检测ANCA。例如：肾小球肾炎，特别是快速进展的肾小球肾炎；肺出血，特别是肺－肾综合征；有系统特征的皮肤型血管炎；多个肺结节；上呼吸道慢性破坏性疾病；长期鼻窦炎或耳炎；声门下气管狭窄；多发性单神经炎或其他周围神经病变；眶后肿块；巩膜炎等^[¹¹^]。同时，ANCA可存在于炎症性肠病、自身免疫性肝病等其他自身免疫病，也可存在于淋巴瘤、药物诱导性血管炎及感染性疾病等^[¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^]。

建议1　推荐对临床疑似AAV患者检测ANCA。ANCA检测也可用于非AAV的自身免疫病如炎症性肠病、自身免疫性肝病等其他自身免疫病，及淋巴瘤、药物诱导性血管炎及感染性疾病等其他疾病患者。

二、ANCA检测方法

ANCA的检测方法包括间接免疫荧光法(indirect immunofluorescenceassay, IIF)、ELISA等^[¹⁸^]。IIF检测ANCA以乙醇和甲醛固定的人中性粒细胞为标准实验基质，为便于更好地进行荧光结果判读，建议同时结合HEp－2细胞等实验基质排除抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)的干扰。IIF检测ANCA时，血清的稀释方法可根据不同的检测试剂而采用倍比稀释系统或√10稀释系统，所用二抗应使用荧光素标记的抗人IgG抗体。

ANCA特异性自身抗体的靶抗原包括MPO、PR3、HLE、LF、LYS、Cath G及BPI等。其中临床主要检测抗MPO抗体和抗PR3抗体，对AAV的分型、临床表现、治疗反应及预后判断具有重要的临床意义^[¹⁹^]，并且其量值改变可用于AAV患者病情监测。因此，建议对抗MPO抗体和抗PR3抗体进行定量检测。针对特异性自身抗体检测的各种免疫学方法，包括ELISA、线性免疫印迹法(line immunoassay, LIA)、高通量流式免疫法(multiplex flow cytometric immunoassay, MFIA)、化学发光法(chemiluminescent immunoassays, CLIA)、荧光酶免疫法(fluorescent－enzyme immunoassays, FEIA)等^[²⁰^]。如MFIA具有高敏感性、高特异性、易自动化、高通量及随时待机检测，但检测成本较高。CLIA具有高敏感性、高特异性、定量及自动化，但检测成本高、需要对每个自身抗体进行逐项检测。目前抗MPO抗体和抗PR3抗体有参考血清，且抗MPO抗体已有标准物质(ERM－DA 476/IFCC)^[²¹^]。但由于抗MPO抗体和抗PR3抗体的不同厂家试剂针对的抗原表位、抗原固定方法及检测技术不同，对患者病情监测时建议选择同一厂家的定量检测试剂进行动态观察。

ANCA检测结果的准确性与试剂、设备及实验操作等多种因素有关，因此临床实验室进行ANCA检测时应有完善可靠的室内质控和室间质评体系，确保实验检测结果的准确性。如IIF－ANCA的室内质控应包括cANCA、pANCA的阳性和弱阳性质控品，以及阴性质控品^[²²^]。此外，ANCA检测技术自动化是今后的发展趋势，应用自动化技术有助于提高临床实验室ANCA检测的工作效率，保证检测流程的标准化及检测结果的一致性。

三、ANCA检测程序

对临床疑似AAV患者，建议IIF－ANCA联合抗MPO抗体、抗PR3抗体检测，可提高对AAV的临床诊断性能^[¹¹^]。对于初诊的临床疑似MPA、GPA患者，可使用高敏感性和高特异性的抗MPO抗体、抗PR3抗体检测方法(如第二代ELISA 、第三代ELISA、CLIA、FEIA等)进行检测。若检测结果阴性，但临床仍高度怀疑小血管炎应使用其他免疫学方法和/或IIF－ANCA进行重复检测^[²³^]。而对于其他ANCA相关疾病患者，建议在IIF－ANCA检测结果阳性后，再进行针对各种靶抗原的ANCA特异性自身抗体的检测。

建议2　采用IIF检测ANCA时，推荐以乙醇和甲醛固定的人中性粒细胞为实验基质。

建议3　采用IIF检测ANCA时，血清的稀释方法可根据不同的检测试剂而采用倍比稀释系统或√10稀释系统，所用二抗应使用荧光素标记的抗人IgG抗体。

建议4　实验室进行ANCA检测时应有完善可靠的室内质控和室间质评体系。IIF检测ANCA的室内质控应包括cANCA、pANCA的阳性和弱阳性质控品，以及阴性质控品。

建议5　抗MPO抗体和抗PR3抗体可采用多种免疫学方法检测，应注意不同检测方法临床应用的优缺点。

建议6　推荐定量检测抗MPO抗体和抗PR3抗体，对患者病情监测时建议选择同一厂家的定量检测试剂进行动态观察。

建议7　建议临床疑似AAV患者，采用IIF－ANCA联合抗MPO抗体、抗PR3抗体检测。而对于初诊的临床疑似MPA、GPA患者，可使用高敏感性和高特异性的抗MPO抗体、抗PR3抗体检测方法进行检测。若检测结果阴性，但临床仍高度怀疑小血管炎，应使用其他免疫学方法和/或IIF－ANCA进行重复检测。

建议8　对于其他ANCA相关疾病患者，建议在IIF－ANCA检测结果阳性后，再进行针对各种靶抗原的ANCA特异性自身抗体的检测。

四、IIF－ANCA荧光模型鉴定要点

IIF－ANCA根据在乙醇和甲醛固定的人中性粒细胞上呈现的荧光染色形态不同，分为cANCA、pANCA及不典型ANCA(不典型cANCA和不典型pANCA)。为确保具有重要临床意义的荧光模型被准确识别以及根据荧光模型判读难易程度不同，建议将ANCA荧光模型分为必报荧光模型(包括：cANCA、pANCA)和选报荧光模型(不典型ANCA：不典型cANCA和不典型pANCA)。具体鉴别要点如下。

(一) cANCA阳性

乙醇固定的人中性粒细胞胞浆呈现弥散的粗细不一的颗粒荧光，胞浆荧光清晰勾勒出细胞及细胞核的形态，分叶核间荧光呈现重染(图1A)；甲醛固定的中性粒细胞呈现上述一致的荧光染色(图1B)。cANCA阳性时通常甲醛固定的中性粒细胞基质上的荧光强度强于乙醇固定的中性粒细胞荧光强度，因此部分患者经治疗后，可能表现为甲醛固定的中性粒细胞荧光染色阳性，乙醇固定的中性粒细胞荧光染色阴性。当ANA阳性时，应注意排除ANA胞浆型荧光的干扰。

图1 胞浆型抗中性粒细胞胞浆抗体阳性的荧光模型(间接免疫荧光染色×200)

(二)pANCA阳性

乙醇固定的中性粒细胞呈现典型的核周胞浆带状荧光染色增强，荧光阳性染色主要集中在分叶核周围，形成环状或不规则的块状，带状荧光向细胞核内浸润或不浸润(图2A)；甲醛固定的中性粒细胞胞浆呈现弥散、粗细不一的颗粒状荧光，胞浆中的荧光可清晰勾勒出细胞及细胞核的形态，分叶核间荧光呈现重染(图2B)。pANCA阳性时通常乙醇固定的中性粒细胞荧光强度强于甲醛固定的中性粒细胞荧光强度，因此部分患者经治疗后，可能表现为乙醇固定的中性粒细胞荧光染色阳性，甲醛固定的中性粒细胞荧光染色阴性。当ANA阳性时，应注意排除ANA细胞核荧光的干扰。

图2 核周型抗中性粒细胞胞浆抗体阳性的荧光模型(间接免疫荧光染色×200)

(三)不典型cANCA阳性

在乙醇固定的中性粒细胞上呈现胞浆中均匀弥散分布的细颗粒状荧光，在核叶间无增强的荧光染色(图3A)；甲醛固定的中性粒细胞呈现上述一致的荧光染色或阴性(图3B)。当ANA阳性时，判断不典型cANCA时需注意排除ANA胞浆型荧光的干扰。

图3 不典型胞浆型抗中性粒细胞胞浆抗体阳性的荧光模型(间接免疫荧光染色×200)

(四)不典型pANCA阳性

乙醇固定的中性粒细胞呈现核周胞浆的平滑丝带状荧光，无带状荧光向细胞核内浸润，荧光阳性均匀分布于核周，无不规则的块状(需排除ANA核膜型干扰)(图4A)；甲醛固定中性粒细胞呈阴性(需排除ANA核膜型干扰；需排除部分患者经治疗后，可能表现为乙醇固定的中性粒细胞荧光染色阳性，但甲醛固定的中性粒细胞荧光染色阴性的pANCA)，或者在甲醛固定的中性粒细胞上呈现胞浆中淡染、均匀弥散分布的细颗粒状荧光，在核叶间无增强的荧光染色(图4B)。

图4 不典型核周型抗中性粒细胞胞浆抗体阳性的荧光模型(间接免疫荧光染色×200)

(五)ANA干扰

1．粒细胞特异性抗核抗体(granulocytespecific anti nuclear antibody，GS－ANA)阳性：

乙醇固定的中性粒细胞核呈现均匀或颗粒样荧光(图5A)；甲醛固定的中性粒细胞呈现阴性(图5B)。以HEp－2细胞为基质检测的ANA荧光染色阴性(图5C)。

图5 粒细胞特异性抗核抗体阳性的荧光模型(间接免疫荧光染色×200)

2．ANA细胞核型阳性：

乙醇固定的中性粒细胞核呈现均质(图6A)或颗粒样(图6B)荧光表现(ANA核膜型阳性则会呈现核周平滑丝带状荧光)；甲醛固定的中性粒细胞呈现阴性(图6C)；以HEp－2细胞为基质检测的ANA荧光染色呈现均质型或颗粒型荧光染色(ANA核膜型阳性则会呈现核周荧光)。由于ANCA和ANA检测的最佳起始稀释度不同，因此乙醇固定的中性粒细胞与HEp－2细胞可呈现荧光强度差异，但不能以此作为判断是否存在ANCA的依据。

图6 抗核抗体细胞核型阳性的荧光模型(间接免疫荧光染色×200)

(六)ANA胞浆型阳性

乙醇及甲醛固定的中性粒细胞胞浆呈现均一的细颗粒荧光(图7A、B)，以HEp－2细胞为基质检测的ANA呈现胞浆型荧光染色(图7C)。

图7 抗核抗体胞浆型阳性的荧光模型(间接免疫荧光染色×200)

建议9　IIF－ANCA荧光模型分为cANCA、pANCA及不典型ANCA(不典型cANCA和不典型pANCA)。推荐cANCA和pANCA为必报荧光模型，不典型ANCA(不典型cANCA和不典型pANCA)为选报荧光模型。

五、ANCA检测结果报告

IIF－ANCA检测结果判读及报告的技术主管应具有专业技术培训(如专业学会组织的培训、进修学习等)及考核合格记录(如考核认证的合格证及岗位培训证等)；其他从事此项工作的技术人员应有定期培训的考核记录，且应定期进行人员间结果判读比对。IIF－ANCA检测报告内容，应包括检测方法、定性结果(阳性/阴性)、荧光模型、滴度、参考区间及必要的临床建议。ANCA特异性自身抗体(如抗MPO抗体、抗PR3抗体)的检测报告内容，应包括检测方法、结果(若为定量检测方法应包含定量数值和单位)、参考区间及必要的临床建议。

建议10　IIF－ANCA检测结果判读及报告人员应有培训、考核记录及定期进行结果判读比对。

建议11　IIF－ANCA检测报告内容，应包括检测方法、定性结果(阳性/阴性)、荧光模型、滴度、参考区间及必要的临床建议。

建议12　ANCA特异性自身抗体(如抗MPO抗体、抗PR3抗体)的检测报告内容，应包括检测方法、结果(若为定量检测方法应包含定量数值和单位)、参考区间及必要的临床建议。

六、ANCA检测结果的临床解读

cANCA阳性，抗PR3抗体或(和)抗MPO抗体阳性，可以见于活动性ANCA相关血管炎患者中。

cANCA阳性，抗PR3抗体和抗MPO抗体阴性，可以见于经治疗后的ANCA相关血管炎患者中。

pANCA阳性，抗MPO抗体和(或)抗PR3抗体阳性，可以见于活动性ANCA相关血管炎患者中。

pANCA阳性，抗MPO抗体和抗PR3抗体阴性，可以见于经治疗后的ANCA相关血管炎患者中。

cANCA阴性/抗PR3抗体阳性或pANCA阴性/抗MPO抗体阳性，可出现在部分ANCA相关血管炎患者中。

不典型cANCA或不典型pANCA阳性，可出现在炎症性肠病、其他自身免疫病及感染等患者中。

七、结语

ANCA检测的实验室影响因素较多，临床应用情况复杂。ANCA检测的临床应用共识有助于提高我国临床实验室对ANCA检测的临床应用范围、临床意义解读水平，有助于规范我国ANCA检测方法、检测程序、荧光模型判读及结果报告，最终为临床提供规范可靠的ANCA检测结果，及正确理解和合理解释其临床意义。