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在寻找内源性细胞凋亡诱导因子时，作者发现E2以浓度依赖的方式诱导HeLa细胞死亡，且在E2处理24h后变化明显，36h达到起始水平的20%。同时，作者还检测了E2相关衍生物，包括雌酮（E1），雌三醇（E3），17-α-雌二醇和两种相关植物化合物（染料木黄酮和玉米赤霉烯酮），发现除E1之外，其它诱导细胞死亡的效果略低于E2，且均未诱导任何明显的细胞死亡。此外，还用类固醇激素如孕酮，睾酮和皮质酮处理HeLa细胞，发现孕酮诱导细胞死亡具有相似的效力，睾酮诱导细胞死亡降低，皮质酮具有甚至更低。为了验证E2诱导的细胞死亡的凋亡性质，作者进行了生化分析，发现caspase-3与caspase-7被激活，并且它们的底物聚（ADP-核糖）聚合酶PARP的剪切形式产生。这种E2诱导的caspase-3/7活化及其引发的PARP剪切可被caspase抑制剂z-VAD-FMK阻断。为了鉴定E2诱导细胞凋亡的途径，作者敲除HeLa细胞中的caspase-8，caspase-9和Apaf-1，并检测了细胞对E2的反应。在E2处理后，caspase-8的敲除不影响caspase-3活化或Cleaved-PARP的产生。然而，敲除caspase-9或Apaf-1完全阻止了caspase-3激活和Cleaved-PARP的产生，表明E2诱导的细胞凋亡是通过线粒体凋亡途径实现的。免疫荧光分析显示E2处理导致细胞色素c从线粒体释放到胞质溶胶中，更是证实了这一点。（图1） 为了更深入的阐明E2诱导的细胞凋亡的分子机制，作者分别敲除线粒体凋亡途径的成分Apaf-1、caspase-9和caspase-3，并检测细胞对E2的反应。敲除Apaf-1、caspase-9或caspase-3虽然都阻断了caspase-3底物PARP的剪切，但只能延缓并不能阻止E2诱导的细胞活力丧失，且未见凋亡小体形成，而这与caspase抑制剂z-VAD-FMK类似。因此，一旦线粒体凋亡途径被激活，抑制caspase活性并不能改变凋亡细胞的命运，而只是改变了死亡的形态。为了验证这一点，作者又对Bax或Bak敲除以及两种基因同时敲除，结果显示Bax和Bak的双重敲除与阻断caspase激活类似，延迟了细胞死亡，而Bax和Bak的单敲除并没有改变E2诱导的细胞死亡。单独敲除Bax或Bak都不能阻止caspase-3的激活和Cleaved-PARP的产生，但当敲除Bax和Bak时，并没有看到caspase-3的激活和Cleaved-PARP的产生，只是细胞死亡形态发生了变化，即从典型的凋亡转变为浓缩细胞质中异质小泡的积累，且阻断了下游caspase的活化，这表明线粒体凋亡途径确实是由E2通过Bax和Bak激活的，并与观察到的凋亡形态有关。此外，检测包括Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1在内的抗凋亡蛋白水平时，发现E2处理细胞24小时后，Bcl-2和Mcl-1蛋白水平显著下降，而caspase抑制剂也无法阻止。而过表达Bcl-2、Bcl-XL或Mcl-1，阻断了E2诱导的细胞凋亡，与Bax和Bak双敲除细胞相似，这些抗凋亡蛋白的过表达只改变了死亡细胞的形态，而没有改变细胞的命运（图2）。综上， E2诱导的细胞死亡是通过下调Bcl-2和Mcl-1的线粒体凋亡途径完成的，但细胞的命运是由这些抗凋亡蛋白上游的事件决定的。 为了研究E2诱导凋亡的线粒体上游分子事件，作者通过化合物文库筛选出了西洛他唑(Cilo)，它能够剂量依赖地阻断E2诱导的细胞死亡。Cilo是一种喹诺酮类衍生物化合物，选择性抑制磷酸二酯酶3型（PDE3）。PDE3强抑制剂trequinsin（Treq）处理进一步证实PDE3抑制剂具有抑制E2诱导细胞凋亡的能力。哺乳动物PDE3家族由PDE3A和PDE3B两个成员组成，而PDE3A敲除对细胞对E2处理更具耐药性。为了证实Cilo和Treq是通过破坏PDE3A的功能发挥作用的，作者敲除HeLa细胞的PDE3A，发现这些细胞对E2没有反应，这表明E2诱导的凋亡需要PDE3A。构建PDE3A不同突变体进行过表达实验，证明对E2诱导的细胞凋亡起作用的是PDE3A本身，而不是其酶活性。此外，EKVX和MCF7细胞敲除PDE3A，然后经由E2与PDE3A抑制剂共处理后，细胞死亡均消失（图3）。综上，E2通过PDE3A介导细胞凋亡。 为了进一步探讨PDE3A如何诱导细胞死亡，作者通过引导RNA（gRNA）定向筛选出Schlafen12（SLFN12），并将其敲除，发现SLFN12敲除再用E2处理并不诱导细胞凋亡，而将SLFN12的cDNA导入这些敲除细胞，能挽救对E2诱导细胞凋亡的敏感性，这说明E2诱导的细胞凋亡需要SLFN12。PDE3A或SLFN12敲除能抑制孕酮、睾酮和皮质酮处理诱导的细胞凋亡，在E2处理后并不引起caspase-3，caspase-7与caspase-9的活化，也不会导致PARP的剪切，同时也不降低Bcl-2或Mcl-1蛋白的水平（图4）。这些结果表明PDE3A和SLFN12在E2诱导的凋亡中作用于Bcl-2家族的上游，与Bax和Bak不同的是，缺乏PDE3A或SLFN12的细胞能抵抗E2引起的凋亡。  细胞经E2处理后PDE3A才与SLFN12共沉淀，Cilo或Treq共处理完全阻断了SLFN12与PDE3A的相互作用，说明这种相互作用仅发生在E2诱导凋亡后。WB实验显示，E2处理后SLFN12-Flag融合蛋白水平高于DMSO处理对照细胞或用E2和PDE3A抑制剂Cilo或Treq共处理的细胞，这表明在E2处理后，SLFN12通过与PDE3A的直接相互作用稳定其蛋白。然后，检测E2处理后SLFN12-Flag蛋白的水平，发现SLFN12-Flag蛋白水平呈时间依赖性上升，进一步的实验证实SLFN12蛋白水平的增加与E2诱导的PDE3A-SLFN12相互作用有关。蛋白酶体抑制剂bortezomib与E2共处理实验，证实PDE3A-SLFN12相互作用可以阻止SLFN12的泛素化降解。（图5）  SLFN12蛋白以依赖PDE3A的方式稳定其蛋白，这提示SLFN12蛋白只有在超过一定阈值水平时才会引起凋亡。为了验证这一点，作者构建了SLFN12敲除细胞株，并转染强力霉素（Dox）诱导表达SLFN12的质粒，在Dox和E2的处理下，SLFN12表达，细胞死亡。有趣的是，这种SLFN12表达诱导的细胞死亡发生在PDE3A抑制剂Cilo存在的情况下（图5I），这表明是SFLN12蛋白而不是PDE3A，导致细胞死亡。此外，SLFN12突变蛋白K213R在E2处理后仍能与PDE3A相互作用，但丢失了诱导凋亡的活性（图5H）。为了探讨升高的SFLN12如何诱导细胞凋亡，作者在SFLN12-/-HeLa细胞系，过表达SFLN12-Flag/HA（WT）与凋亡缺陷型SFLN12突变体（K213R），发现与SLFN12(K213R)相比，SLFN12(WT)显著富集的9种蛋白都是核糖体成分，这些核糖体蛋白与SLFN12(WT)相关，并对其中三种进行WB验证，证实核糖体蛋白RPS27A、RPS6和RPL7A与SLFN12(WT)相关，而与SLFN12(K213R)无关。此外，这种相关性发在E2处理的细胞，caspase抑制剂z-VAD-fmk并不影响SLFN12 (WT)和这些核糖体蛋白之间的结合。为了探究这些核糖体蛋白与SLFN12的关联是否依赖于完整的核糖体，作者用RNaseA处理细胞裂解物来破坏核糖体，发现确实消除了这种关联，这说明PDE3A-SLFN12相互作用是SLFN12与核糖体结合前的上游事件。进一步实验分析，证实细胞中升高的SLFN12与核糖体结合，以防止SRPs招募，阻断蛋白在ER的翻译。  虽然观察到E2诱导的细胞凋亡很强烈，但其所需的雌激素及相关激素远高于人血清浓度。然而，在胎盘等产生激素的局部环境中，雌激素和孕酮的水平远远高于诱导细胞凋亡的浓度。有趣的是，部分胎盘绒毛滋养层细胞在胎盘发育过程中表现出凋亡的迹象，包括caspase-3的活化、PARP的剪切和DNA的破碎。此外，还在合体滋养层细胞中检测到凋亡标记物。因此，作者对自然流产的胎盘进行分析，以探究合体滋养层细胞的凋亡是否由SLFN12介导。结果显示，PDE3A在子宫内膜组织和胎盘中均有表达，但SLFN12信号在合胞芽和绒毛状合胞滋养细胞中都检测到，而子宫内膜和内侧增殖的单核滋养层细胞中均未见。进一步的免疫荧光分析，SLFN12信号分布在多核合胞芽和合体滋养层，且与活化的caspase-3信号共定。此外，作者还用滋养层细胞系HTR-8/SVneo来检测其对E2的反应，证实滋养层细胞凋亡确实是由PDE3A和SLFN12介导的。 生命树之谜： 中国科学院动物研究所生殖病理学研究组 BOSS简介： http://sourcedb.ioz.cas.cn/zw/zjrc/200907/t20090716_2088415.html Lab简介： http://rpb.ioz.cas.cn/yjz/wangyanling |
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