【原】基因工程抗体

你的单抗杂交瘤细胞株产不出抗体，不妨试试基因工程抗体

基因工程抗体的概念比较广

本文仅仅讨论怎么从杂交瘤细胞株开始做基因工程抗体

主要解决如下几个问题：

1.    知识产权保护的需要，给细胞株建立指纹身份；

2.    更容易发文章；

3.    序列比细胞株更容易保存；

4.    对于不容易从腹水或者培养制备抗体的细胞株换个思路

5.    人源化抗体的需求

6.    嵌合抗体潜在需要

从杂交瘤细胞株做单克隆抗体，主要解决分三大步骤：

1.    杂交瘤细胞株测序

测序的方法主要有两种，

1)兼并引物设计（degenerate primer）分别扩增抗体重连和轻链的可变区

2)RACE法，RACE即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends),是一种基于逆转录PCR从样本中快速扩增cDNA的5′端及3'端的技术

方法1）更加的节约成本，便捷高效；但是很多的实验室不掌握核心的兼并引物设计方法，只能选择RACE方法。

2.    载体构建

分别构建重链和轻链的表达质粒，表达载体的选择和元件优化组合尤为重要，除了大家认为密码子优化问题，还有载体的信号肽选择尤为重要，这个决定抗体的表达水平，一般优先选择V5信号肽，当抗体产量不高的时候也可以试试其他的信号肽，筛选最优；当然载体的抗体的骨架选择也是需要注意的。

3.    共转染哺乳动物细胞表达

抗体的表达一般选用HKE293或者CHO细胞系，好用的细胞系一般都是商业化公司压箱底至宝，不会轻易流出，其配套的转染试剂和培养基也是经过特殊优化的，培养基和转染试剂是可以公开出售的。

进行以上实验，必须要1.2.0*10^6以上的杂交瘤细胞，越纯越好；杂交瘤细胞株测序的难点在于基于PCR的引物对的设计，很多实验室没有这个技术，按照文献发表的序列重复，往往也效果不好；这个时候可以委托专业化公司帮忙。

基因工程表达抗体的益处：

长期做单抗的实验室都知道，经常遇到杂交瘤细胞株产生抗体能力越来越弱或者抗体效价越来越低，主要原因可能是抗体基因发生突变，因此早期测序留住抗体基因尤为重要，对于规模化生产单抗的均一性更为重要。

现在很多的公司或者实验室推出所谓的抗体氨基酸测序，目前这个技术不是很成熟，相对于抗体基因测序也不够精确。抗体氨基酸测序一般是把抗体的重链和轻链去糖基化，再用蛋白酶切断，通过质谱鉴定，然后计算机拼接，这里面的难点：1.算法不一定科学；2.质谱鉴定中区分亮氨酸/异亮氨酸相对困难。