|
复旦大学医学分子病毒学重点实验室 HBV慢性感染迄今仍然是世界性公共健康问题，研究HBV病毒学机制、发展有效的抗病毒治疗策略具有重要的科学意义和社会意义。HBV是一种小的DNA包膜病毒，属于嗜肝DNA病毒科，成熟粒子中含有约3.2 kb松弛环状DNA（rcDNA）基因组。在病毒感染的肝细胞核内，rcDNA修复为共价闭合环状DNA（cccDNA），是病毒转录复制的原始模板。cccDNA转录的病毒前基因组RNA（pgRNA）在细胞浆内包装入核衣壳，通过反转录起始病毒DNA合成，成熟的病毒核衣壳颗粒再次转运至细胞核，完成细胞内的病毒复制周期。 HBV cccDNA通过从头感染的病毒粒子或细胞浆内新合成核衣壳粒子中的rcDNA修复而成。病毒双链线性的DNA复制中间体则可能通过非同源末端联接方式形成非功能性的cccDNA。rcDNA修复生成cccDNA的分子机制尚不是很清楚，通常认为包括正链补齐，去除共价结合的病毒多聚酶蛋白和其他冗余成分，以及最终完成DNA末端连接等步骤。rcDNA修复生成的cccDNA具有超螺旋结构，并结合组蛋白等形成串珠样核小体结构的微小染色体，具有显著的表观遗传学修饰特征。cccDNA生物合成是HBV复制过程中的限制性步骤。在慢性感染者的肝穿刺样本中，每单个肝细胞中平均约含有0.01~1.4拷贝，或者0.1~9.0拷贝的cccDNA。尽管较低的拷贝数，细胞内cccDNA却具有显著的稳定性，是HBV持续感染的分子基础。cccDNA在抗病毒药物抑制条件下仍具有较长的代谢周期，能通过细胞分裂传递至子代细胞，细胞凋亡或坏死是其体内代谢的主要途径。现有的抗病毒药物能有效抑制病毒复制和rcDNA形成，但难以清除cccDNA，是HBV慢性感染患者难以彻底治愈的根本原因，也因此代表了抗病毒药物研发的关键靶点。 在过去的数十年中，尽管HBV研究领域获得了令人瞩目的成就，但对HBV cccDNA形成、维持和降解等代谢机制仍缺乏深入细致的了解。HBV cccDNA相关研究常常受制于缺乏合适的实验模型和简单可靠的检测方法。HBV检测技术在本期的其他论文中有详细描述，本文将围绕近年来HBV cccDNA体外细胞模型和实验小鼠模型的重要进展进行综述和分析。 1 cccDNA研究的体外细胞培养模型 1.1 病毒感染细胞模型 原代肝细胞模型 分化的原代人肝细胞（PHH）能够被HBV感染，由于其正常（非肿瘤）的细胞特性，适合于对病毒宿主相互作用的研究，尤其是宿主细胞抗病毒天然免疫机制的研究。例如，应用HBV体外感染PHH模型的研究发现，HBV感染呈现一种所谓“隐蔽”方式，并不激活宿主细胞天然免疫机制，同时也不产生对其他共感染病毒的抑制，因此证实了早先基于黑猩猩体内感染模型的研究结果。Lucifora等则报道α干扰素能够诱导APOBEC3A和3B在肝细胞中的表达，后者通过胞嘧啶脱氨基作用实现对HBV cccDNA的修饰和清除。表观遗传学研究则显示α干扰素显著抑制病毒感染PHH细胞中cccDNA的转录活性。有意思的是，沉默的染色质结构特征似乎提示cccDNA稳定性的增加。 PHH是研究HBV感染最贴近自然的细胞模型，然而，PHH不易获得，增殖缓慢，且难以在体外维持其分化状态，在接种后不久就会失去病毒易感性。Ortega-Prieto等最近报道了一种改进的三维（3D）微流体PHH体外培养系统，能够长期稳定表达特定的肝细胞基因（＞40 d），且能够在极低的感染复数条件下实现对PHH的感染。与其他HBV体外感染体系不同，3D 培养PHH模型中HBV起始和维持感染并不依赖二甲基亚砜和聚乙二醇。病毒感染21 d后，每个PHH细胞中可检测到约2拷贝的cccDNA，α干扰素处理细胞不能抑制cccDNA形成。值得注意的是，应用特定培养基可诱导PHH去分化，使其获得体外大量增殖的能力；基于3D球状培养重新诱导分化的细胞具有PHH的主要特征，并支持HBV感染和cccDNA形成。Fu等研究发现，HBV感染的PHH去分化扩增后不能检测到cccDNA以及病毒抗原表达，但重新诱导分化的PHH样细胞出现HBV病毒学反弹，cccDNA水平显著增高，提示cccDNA能够通过细胞分裂大量遗失，却并不能完全清除。以上这些PHH模型的研究进展，如具有较好的重复性和可行性，必将极大推动HBV病毒学和cccDNA相关研究。 肝肿瘤细胞模型 HepaRG细胞最初从HCV感染相关肝肿瘤样本中筛选和发展获得，能够在二甲基亚砜和氢化考可地松诱导分化条件下获得HBV感染能力，并表达肝细胞特征性蛋白。由于首次报道肝肿瘤细胞系支持HBV从头感染，随后十多年中成为HBV研究领域最炙手可热的研究工具之一。HepaRG模型实验条件较为苛刻，通常需要4周的培养分化时间，且依赖较高的病毒细胞感染复数以实现感染。应用HepaRG感染体系的研究显示，HBV从头感染动力学过程缓慢，rcDNA修复为cccDNA的效率较低，建立感染后cccDNA拷贝数并不出现显著扩增。应用杆状病毒系统携带HBV基因组转导HepaRG细胞，诱导显著的Ⅰ型干扰素应答，抑制和清除HBV在HepaRG细胞中的复制，这一结果似乎与前文提及的HBV“隐蔽”感染的特征并不一致，推测与杆状病毒载体特征相关。 HepG2和Huh7细胞系是最常用的肝癌细胞系，能够支持基于HBV DNA复制子模板的病毒复制，且易于遗传学操作。然而由于缺乏病毒进入受体，它们都不被HBV感染。牛磺胆酸钠协同转运多肽（NTCP）已被证明是HBV和HDV的高亲和力受体，稳定表达外源性NTCP使得HepG2和Huh7细胞能够被HBV感染，应用Southern blot杂交分析能够检测到cccDNA形成。基于HepG2NTCP体外感染系统，Qi等应用siRNA筛选证实，宿主DNA多聚酶κ可能是cccDNA修复过程中正链缺口补齐的主要分子机制；特异性敲低DNA连接酶1或3的表达，能够显著抑制HBV cccDNA的形成，提示宿主DNA修复机制在HBV cccDNA生物合成过程扮演了重要角色。由于尚不清楚原因，小鼠肝脏细胞并不支持cccDNA形成。表达人NTCP的小鼠肝肿瘤细胞系，或表达人NTCP的转基因小鼠，并不能支持HBV的从头感染。Cui等最近报道在HBV诱导表达的小鼠AML12HBV10细胞系中鉴定到cccDNA，并发现AML12HBV10细胞中成熟的病毒核衣壳粒具有显著的不稳定性。 1.2 cccDNA从头合成的转染细胞模型 应用携带线性HBV基因组复制子的质粒转染肝肿瘤细胞系HepG2或Huh-7，能够在细胞中产生病毒RNA和DNA复制中间体，后者在细胞核内进一步修复成为cccDNA。瞬时转染的优势在于质粒DNA自身可看做是一种cccDNA替代分子，但这一模型新产生的野生cccDNA拷贝数极低。鸭乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus, DHBV）在病毒基因构成等方面与HBV具有较大的相似性，因此作为模型系统被广泛地用于HBV病毒学研究。值得注意的是，应用敲除包膜蛋白基因的DHBV复制子质粒转染鸡肝肿瘤细胞系LMH，每单个细胞中平均能够产生约200~400分子的cccDNA。然而在HBV质粒中敲除包膜蛋白基因并不能产生类似效应。进一步的研究显示，HBV和DHBV自身病毒学因素决定了cccDNA从头合成的效率，而宿主细胞种系特征并不显著。 另一方面，研究者发展了HBV DNA稳定转染的细胞系，最为著名的是HepG2.2.15和HepAD38细胞系，前者在宿主细胞基因组中整合并稳定表达HBV基因组，后者则应用四环素（tetracycline, tet）表达调控体系（tet-off）诱导HBV pgRNA和HBcAg的表达。相对于HepG2.2.15细胞系，tet-off诱导表达的HepAD38细胞中病毒复制和cccDNA形成更为显著，易用Southern杂交等方法检测，是HBV cccDNA研究的重要工具之一。为实现基于细胞模型的抗病毒药物高通量筛选，Guo等巧妙地发展了HepDE19细胞模型，研究者设计构建tet-CMV启动子控制的HBV基因组编码质粒，其5’端删除HBeAg的翻译起始码；正链DNA合成实现模板转换并修复为cccDNA后，HBeAg则获得完整蛋白的读码框，其分泌产物因此可指示cccDNA的从头合成。由于HBeAg蛋白质序列与HBcAg大部分重合，研究者进一步在其N端（epsilon序列后）设计融合了一段（9 aa）HA标签序列，证实并不影响HBV复制。 1.3 病毒复制子转染细胞模型 线性复制子模型 HBV相关体内、体外研究中多采用线性化的病毒复制子系统，即质粒或重组病毒载体编码部分重复或多拷贝串联重复的HBV病毒基因组。在转染细胞中，线性复制子编码质粒可替代cccDNA模板起始病毒复制周期，并从头合成野生型cccDNA。质粒复制子系统的优势在于分子生物学操作的便利性，可广泛应用于HBV病毒突变体的研究。由于具有较大的基因组长度、以及携带大量的外源性片段（例如原核特征的质粒复制和抗性筛选元件等），DNA质粒或重组病毒载体可能具有与3.2 kb HBV cccDNA显著不同的病毒学特征和宿主反应性。Günther 等应用HBV单拷贝基因组DNA（PCR或多拷贝串联基因组的酶切产物）转染肝肿瘤细胞系，具有黏性末端的线性DNA转染细胞后，通过细胞内修复机制环化，成为HBV转录和复制的替代模板，进而由病毒的细胞内复制机制从头合成cccDNA。这一模型简便易行，早期HBV cccDNA表观遗传学的一些重要研究正是基于该模型展开的。然而，线性DNA环化机制和效率并不清楚，环化的DNA模板与新生cccDNA的区分也比较模糊。在最近的报道中，Bogomolov等应用T4连接酶连接线性的病毒DNA基因组，通过琼脂糖电泳和胶纯化获得具有超螺旋结构特征的cccDNA替代分子。 HBV重组cccDNA（rcccDNA）模型 本课题组实验室在研究中发展了一种通过位点特异性重组获得rcccDNA的策略。rcccDNA与野生病毒cccDNA具有较大相似性，能够在细胞内或体外系统大量诱导产生，是HBV病毒学研究的一类重要工具。HBV基因组高度压缩，难以容纳外源性序列。作者在HBV基因组两侧引入同向loxP位点，由重组酶Cre引发loxP位点之间的DNA重组和环化，生成含有单拷贝loxP位点的rcccDNA；loxP位点则位于一段约90 bp的外源性内含子中（HBsAg基因近5’端），可在RNA转录过程中移除，实现所谓的无缝插入。另一方面，作者基于大肠杆菌PhiC31重组酶诱导表达系统，建立了一种体外诱导rcccDNAattR微环产生和纯化的策略。纯化的rcccDNAattR微环具超螺旋结构，能够支持功能性的HBV复制和抗原表达。值得指出的是，由于rcccDNA编码的外源内含子序列，应用引物特异性PCR方法易于与HBV DNA复制中间体、以及从头合成的新生cccDNA区分。由于首次建立HBV rcccDNA体外培养细胞模型，这一工作受到了广泛关注。罗氏研发团队的报道中将39 bp的attR位点设计插入在HBV多聚酶基因的spacer区（PreS1起始密码子前），显示并不影响病毒复制。Li等则将Gaussia荧光素酶报告基因插入到HBcAg编码框中，应用体外微环DNA重组和纯化技术获得rcccDNAattR，并证实能够在转染Huh-7细胞中产生子代病毒。尽管大片段外源基因插入cccDNA是否支持病毒复制具有争议，上述cccDNA替代分子的研究无疑为高通量药物筛选提供了一个快速、灵敏的体外测试平台。 2 cccDNA研究的实验小鼠模型 2.1 人肝细胞嵌合小鼠模型 小鼠是生物学研究中最为广泛应用的模式动物，然而HBV并不感染小鼠肝脏细胞，如前文所述，表达人NTCP蛋白的小鼠肝脏细胞并不支持HBV从头感染和cccDNA形成。Rhim等首先报道了一种基于尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）转基因的肝细胞嵌合小鼠模型。uPA具有肝细胞毒性，将 uPA 转基因小鼠与严重联合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）杂交后，异源移植的肝细胞具有显著的生长优势，因此可建立易感 HBV 的人源化肝脏。延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH）基因敲除是另一种常见的人肝细胞嵌合鼠模型策略。FAH 基因敲除会导致酪氨酸代谢产物的累计和肝细胞死亡，2-硝基-4-三氟甲苯-1，3环己二酮则能特异性地阻断上述过程，维持FAH敲除小鼠的生存。在免疫缺陷的FRG（Fah–/–Rag2–/–Il2rg–/–）小鼠模型中，人肝细胞的比例甚至可高达95%。 人肝细胞嵌合小鼠模型对cccDNA生物学特征的研究具有重要意义。Volz等应用uPA/SCID小鼠模型的研究发现HBV建立感染是一个缓慢的过程；在进入感染扩增期后，应用进入抑制剂Myrcludex-B甚至抑制了cccDNA池的扩增，提示后者更多来自于病毒的从头感染，病毒细胞内复制的补充作用则并不明显。非常有意思的是，来自同一课题组最近的研究发现：（1）HBV感染的PHH在uPA/SCID小鼠体内增殖的能力减弱；（2）随着病毒感染细胞在体内的增殖，cccDNA被逐渐稀释且出现部分“丢失”。尽管这种“丢失”的相关分子机制并不清楚，这一发现为发展有效的抗病毒策略以清除cccDNA找到了“阿喀琉斯之踵”；（3）此外，HBV感染的极少部分PHH细胞缺乏增殖潜力，可能代表了cccDNA在体内稳定存在的储存库。这一研究代表了近期HBV研究领域的一项重要成果，为发展HBV治愈性策略提供了新的线索和思路。 2.2 应用高压水动力注射的体内转染小鼠模型 基于高压水动力注射的小鼠实验模型近年来受到广泛关注。HBV编码质粒可作为一种cccDNA替代模板，由尾静脉高压水动力注射，通过体内转染方式绕开潜在的病毒受体屏障，建立基于HBV编码质粒的肝细胞内病毒复制。约4%~8%的小鼠肝细胞能够通过这一途径被有效转染，同时，一过性表达的病毒抗原作为异己成分激活宿主免疫应答，在免疫机能正常小鼠模型中诱导类似急性病毒性肝炎的病理过程。值得注意的是，Huang等应用重组腺相关病毒（AAV）质粒载体携带HBV复制子，通过高压水动力注射C57BL/6小鼠，超过40%的小鼠可检测到持续的HBsAg抗原血症，病毒抗原的持续表达甚至超过一年，推测与重组AAV质粒载体特征直接相关。高压水动力注射简便易行，HBV质粒系统和小鼠的遗传学操作也易于实现，已经成为HBV研究中最为重要的体内实验模型。 携带HBV复制子的DNA质粒可能具有与HBV cccDNA不同的病毒学特征和宿主反应性。作者在研究中发现，与HBV复制子编码质粒相比，rcccDNA能够在高压水动力注射小鼠模型中诱导延长的病毒抗原血症（5~7周），因此能够作为一种基本策略发展HBV持续感染的小鼠模型。进一步，希望在模拟体内慢性肝炎的条件下分析cccDNA稳定性特征。（1）通过引入shRNA敲低rcccDNA共转染肝细胞表面的β2-微球蛋白，下调病毒感染细胞的MHC-Ⅰ类抗原递呈；（2）通过敲除HBV X蛋白基因；（3）通过具有DNA结合能力的Cre-kox1融合蛋白，实现rcccDNA的表观遗传学沉默，诱导高压水动力注射rcccDNA在小鼠模型中的持续表达（图1）。但在HBV复制子编码质粒中敲除HBV X蛋白，或共表达β2-微球蛋白基因特异的shRNA，并不能显著延长小鼠模型中的病毒抗原血症，显示HBV (r)cccDNA具有不同于普通质粒DNA的稳定性特征。 图1建立重组cccDNA持续表达和慢性感染的实验小鼠模型a：应用shRNA敲低β2-微球蛋白，下调病毒感染细胞MHC-Ⅰ抗原递呈；b:诱导重组cccDNA表观遗传学抑制；c:应用重组腺病毒载体投递重组cccDNA; d~e:病毒载体投递的重组cccDNA 诱导抗原持续表达和慢性肝炎 2.3 基于重组病毒载体转导的小鼠模型 重组AAV载体由于其安全性好、宿主细胞范围广，被视为最有前途的基因治疗载体之一。董小岩等和Dion等先后报道，应用高嗜肝性的重组AAV2 或AAV8载体经尾静脉注射小鼠模型，能够诱导HBV转基因在小鼠肝脏中的持续性表达，注射5×1010病毒基因组12周后，仍检测有60%的肝细胞为HBcAg阳性。由于持续感染和显著的肝脏免疫耐受特征（显著增加的调节性T淋巴细胞和功能损伤的效应 T淋巴细胞），AAV-HBV小鼠模型被广泛应用于抗病毒和主动免疫治疗策略的评价。Lucifora等报道在AAV-HBV重组载体感染的小鼠肝脏中，应用 “金标准”Southern杂交方法检测到HBV cccDNA形成，因此对“小鼠肝细胞中不能形成cccDNA”的普遍认识形成了挑战；另一种假设则是，上述的cccDNA可能来自于与AAV-HBV细胞内中间体的重组产物，进一步设置HBV复制缺陷的对照实验将有助于正确的认识。 慢性肝炎实际反映了机体不充分的抗病毒免疫效应，以及这一效应对肝组织持续的病理损伤。因此，如何在免疫机能正常小鼠中引入部分功能的抗病毒免疫机制，是发展慢性病毒性肝炎小鼠模型的关键科学问题。Protzer研究组应用重组腺病毒载体（Ad）携带HBV 基因组感染免疫机能正常的小鼠模型，尽管Ad具有显著的免疫原性，在低剂量感染条件下仍诱导HBV持续性表达和功能耐受的病毒特异性T淋巴细胞应答。作者在最近的工作中，则利用Ad载体实现rcccDNA在小鼠肝脏的投递。在1.5×109 PFU注射剂量下，重组Ad载体经由静脉感染Alb-Cre转基因小鼠大多数的肝细胞，通过位点特异性重组并产生rcccDNA，诱导持续高水平的HBV抗原血症；病毒持续感染诱导功能缺陷的T淋巴细胞应答，同时伴随血清转氨酶水平的升高，提示持续的肝细胞坏死性炎症；组织化学分析则进一步提示小鼠肝脏中纤维化形成。该研究将有助于对HBV持续感染和相关疾病过程的理解，同时也代表了一种重要的体内实验模型系统进行抗病毒药物筛选和评价。 3 总结 cccDNA是HBV慢性感染的分子基础和重要治疗靶点。在常用的体外模型中，PHH是天然的HBV宿主细胞，易于感染HBV，但其扩增性差，难以在体外维持分化状态，而近期干细胞领域的进展可能使其具有更为广阔的应用前景。肝肿瘤细胞系是应用最为广泛和有效的工具，能支持HBV复制和cccDNA形成，易于分子和细胞生物学的各种操作；过表达NTCP的HepG2细胞能够支持病毒感染并从头合成cccDNA，是近期HBV研究领域的一项重大突破。缺乏合适的实验动物模型一直是HBV病毒学和免疫学研究的瓶颈。人肝嵌合小鼠模型能够模拟自然感染，是目前最为有效的 cccDNA 体内实验模型，然而由于技术操作复杂，可应用性较为局限；另一方面，免疫缺陷背景也是这一类模型的主要限制之一。DNA高压水动力注射小鼠模型操作简便，然而转染效率较低、表达持续时间较短。小鼠肝脏中投递rcccDNA代表了一种重要的体内实验模型系统，可用于HBV持续性感染和宿主病理机制的研究。值得指出的是，rcccDNA策略为抗病毒药物研究和高通量筛选提供了便利和高效的平台，因而获得广泛关注，先后建立了与罗氏、赛诺菲、强生等大型制药公司和研发机构的合作研究。希望通过以上cccDNA实验模型的介绍，能够有助于加深研究者对HBV病毒学的理解。实际上，发展cccDNA模型系统本身也是对HBV病毒生物学特性的不断探索，相信随着科学的进一步发展，将会有更为理想的cccDNA模型系统问世，为人类最终攻克HBV奠定基础。 引证本文：SU Y, ZHU YF, TIAN QY, et al. In vitro cell model and mouse model of HBV cccDNA[J]. J Clin Hepatol, 2019, 35(6): 1205-1211. （in Chinese) 苏瑜, 朱园飞, 田青右, 等. HBV cccDNA的体外细胞模型和实验小鼠模型[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(6): 1205-1211. |
|
|
