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西安交通大学第二附属医院 自噬与肝癌发生发展的关系 1 不同病因导致的肝损伤中细胞自噬的作用机制 我国肝癌发生的原因多见于慢性HBV和HCV感染，此外还与酒精性及非酒精性脂肪肝相关。HBV诱导的肝细胞自噬通常是由HBVx蛋白（HBx）诱导的，HBx是HBVx基因编码的一种多功能潜在性肿瘤蛋白，在慢性肝炎、肝硬化和肝癌中发挥重要作用。HBx可通过抑制Beclin 1与bcl-2结合和JNK-ROS信号通路启动自噬。其他HBV蛋白如HBsAg可通过与折叠错误的蛋白结合（即内质网应激反应）诱导自噬。但有趣的是，自噬的发生在肝癌中的作用是一个复杂的双向调节过程，虽然HBx和HBsAg可通过不同途径启动和诱导自噬发生，但HBx在体内同时发挥出另一方面的作用，通过对ATP酶与mTOR的诱导，导致溶酶体酸化和降解能力降低，两方面共同作用下，最终体内自噬作用是减弱的。自噬启动的增加及溶酶体工作能力的降低，共同导致了p62堆积，从而促进病毒感染，导致肝细胞坏死及凋亡增加。而p62的异常堆积可活化核转录因子E2相关因子2（Nrf2），启动抗氧化应激反应，使肝细胞在氧化应激条件下增加癌变风险。 LIU B, FANG M, HU Y, et al. Hepatitis B virus X protein inhibits autophagic degradation by impairing lysosomal maturation［J］. Autophagy, 2014, 10(3): 416-430. HCV相关肝癌发生发展的过程中，细胞自噬的作用较为复杂，其促进肝癌的机制可能与促进病毒复制及扩散有关，此外还与增加肝癌细胞对化疗药物抵抗能力相关。研究表明，自噬形成的双层膜结构可能为HCV翻译提供了场所和原料。HCV非结构蛋白4B(NS4B)与Vps34、Ras相关蛋白5(Rab5,一种小GTP 酶家族的成员)结合形成复合物，正向调控自噬发生，但抑制自噬前体形成及自噬溶酶体降解，导致异常蛋白质降解能力减弱，自噬降解能力减弱可导致HCV复制增加，肝细胞内病毒堆积，细胞内脂质堆积，进而肝细胞脂肪变性增加，肝细胞坏死、癌变可能增加。 同样的，高脂饮食则会导致机体自噬受损，从而加速非酒精性脂肪肝向肝癌发展。高脂饮食影响自噬的机制可能是活化mTOR或抑制AMPK，进而抑制自噬起始复合物ULK1形成。在小鼠模型和体外实验中，通过敲除ATG5或使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤后，小鼠肝细胞中甘油三酯和胆固醇含量明显增多，形成脂滴，且肝细胞脂肪变性增多。另有研究表明，高脂饮食环境下，活性氧自由基增多，肝细胞内CD4+T淋巴细胞凋亡增加，抗肿瘤免疫效应减弱。 酒精性脂肪肝到原发性肝癌的发展过程中，细胞自噬起先是被促进的，但后来则转为抑制。在急性乙醇暴露环境下，肝细胞自噬增加，此时自噬作为一种保护机制，清理大量受损线粒体和ROS自由基，促进乙醇代谢等。乙醇被氧化分解代谢主要是通过肝脏乙醇脱氢酶和细胞色素P4502E1催化反应。但在用乙醇处理人肝癌细胞的模型中，观察到细胞色素P4502E1抑制了细胞自噬，并促进了脂质堆积，其机制可能是慢性乙醇暴露环境下，长期内质网应激条件下，自噬效应减弱，溶酶体融合、降解自噬小体能力降低，因为内质网含自噬小体形成需要的膜结构和蛋白质。 2 细胞自噬抑制肝癌发生 自噬可以抑制慢性肝炎或肝硬化向肝癌转变，而自噬缺乏则可能会导致肝癌发生。小鼠饥饿实验中，24 h内小鼠肝脏35%的蛋白质经自噬途径降解。Takamura等研究中，ATG5或ATG7基因缺失的6~9月龄小鼠模型发生肝肿大或肝肿瘤，并且肝癌细胞中有大量泛素化蛋白堆积，而正常肝细胞则没有；肝肿瘤发生可能起源于自噬缺失的肝细胞，具体机制可能与线粒体肿胀、p62堆积、氧化应激、DNA损伤反应等有关。此外，在ATG7缺乏的小鼠模型中特异性下调p62表达后，肝肿瘤体积减小，表明p62堆积对肝癌发生可能起促进作用。Bao等研究发现，在石蜡包埋的肝癌组织切片中发现肝癌细胞中有p62蛋白堆积，但周围未发生癌变的正常肝细胞中则未发现p62的异常堆积。 此外，自噬还可通过调控免疫来发挥抗肿瘤作用。多种人类实体肿瘤细胞中都存在自噬活性的改变，且研究表明自噬与肿瘤免疫应答具有很大的相关性。在肿瘤固有免疫中，自噬可参与肿瘤相关巨噬细胞分化，进而影响肿瘤新生血管生成、免疫抑制和侵袭转移，当自噬受抑制时，巨噬细胞向M2型分化，促进肿瘤血管生成；反之巨噬细胞向M1型分化，抑制肿瘤进展。在肿瘤特异性免疫中，自噬在T淋巴细胞存活、发育、稳态及功能调节中发挥重要作用，有研究表明自噬缺陷的T淋巴细胞内线粒体数量异常增加，ROS增加，所以自噬可能通过细胞稳态影响T淋巴细胞发挥功能；还有研究表明自噬缺陷的B祖细胞不能发育成为前体B淋巴细胞；自噬还可参与抗原递呈过程，一方面自噬形成的降解产物可以被递呈到主要组织相容性复合物Ⅰ或Ⅱ类分子表面增强特异性免疫应答，另一方面，肿瘤自噬小体可作为树突状细胞（DC）的交叉递呈抗原，更有效地提升CD8+ T淋巴细胞应答能力。 肝癌中肿瘤免疫与自噬的关系尚未完全明确。研究表明，缺乏自噬的肝脏Kupffer细胞可以通过mtROS-NF-κB-IL-1a/b通路促进肝硬化和肝癌发展。自噬缺陷协同脂质堆积可造成肝内CD4+T淋巴细胞耗竭。细胞自噬还被证实可被诱导增强TGFβ介导的抗肿瘤作用，IFNγ可通过非凋亡性细胞死亡抑制Huh7肝癌细胞增殖，敲除自噬后，IFNγ抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞死亡的作用消失。 此外，另有研究表明自噬可通过抑制抑癌基因的表达或活化原癌基因促进肝癌发生。在ATG5敲除的小鼠模型中，由于自噬缺陷，抑癌基因p53表达增加，小鼠只发生肝良性肿瘤而不恶变。这进一步提示，自噬在肝癌发生中的作用及机制非常复杂，可能受到诸多因素调控，但其重要性则毋庸置疑，仍需更多的研究探索其机制。 GUO JY, XIA B, WHITE E. Autophagy-mediated tumor promotion［J］. Cell, 2013, 155(6): 1216-1219 3 细胞自噬促进肝癌发展 一旦肿瘤发生后，细胞自噬则转为促进肝癌发展的作用。首先可能与自噬维持细胞内稳态、提供营养物质有关，这成为肝癌发展的一大促进条件。肿瘤细胞代谢高，且多处于低氧低pH环境，而细胞自噬使肿瘤细胞在饥饿、应激反应状况下通过降解各种受损细胞器、异常蛋白质得以存活。研究表明在低氧环境下，50%~60%的肿瘤细胞中自噬活动明显增多。一项针对156例肝癌患者的研究证实LC3-Ⅱ的自噬表达水平随着肝癌病程延长而增加，且与恶性转移和低生存率呈正相关。其次自噬还可通过提高肝癌细胞的化疗抗性等促进肿瘤发展，如自噬基因Beclin 1或ATG5缺失时，索拉非尼的杀伤肿瘤细胞能力更强，且抗肿瘤增殖能力也提高。还有研究表明，乌司他丁可抑制肝癌细胞SMMC-7721自噬，从而减弱表柔比星治疗肝癌时的化疗抵抗。 自噬与肝癌免疫治疗 肝癌预后差，目前治疗手段有限及临床疗效不佳也是主要原因，免疫治疗研究的显著进展为寻找肝癌新的治疗手段指明了方向。肿瘤免疫治疗主要包括免疫检查点抑制剂治疗、过继免疫细胞治疗和肿瘤疫苗等。多项研究表明自噬不仅影响调节性T淋巴细胞、抗原递呈细胞、肿瘤相关巨噬细胞等免疫细胞的发育生长及主要组织相容性复合物抗原递呈过程，还可影响细胞因子的产生、趋化作用等。鉴于自噬在肝癌发生发展过程和机体免疫中的重要作用，研究自噬的作用机制可能为肝癌免疫治疗找到新的靶点。 1 免疫检查点抑制剂治疗 免疫逃逸是指肿瘤逃避了机体免疫系统的识别和攻击，在机体生存并增殖的状况，免疫检查点蛋白失调是免疫逃逸的主要机制之一。现研究较多的免疫检查点主要有程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体（PD-L1）以及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）。 研究发现PD-1可抑制自噬途径，并促进肝癌发生，可能机制是与mTOR下游分子核糖体蛋白分子S6(RPS6)和真核起始因子4E（eIF4E）结合，促进其磷酸化，经此途径调节自噬，联合PD-1抗体和mTOR抑制剂可以产生比各自单独更强的抗肝癌效应。PD-1和PD-L1结合后可阻断T淋巴细胞增殖、活化和产生细胞因子，因此阻断该途径可破坏肿瘤的免疫逃逸。其中PD-1抗体nivolumab治疗肝癌已完成Ⅰ、Ⅱ期试验（NCT01658878），证明了该药物的有效性、安全性可控，基于此在2017年已被美国食品与药品管理局列为肝癌的二线用药；另一抗体pembrolizumab现处于肝癌治疗的Ⅲ期试验（NCT02702401）。现用于肝癌治疗的PD-L1抗体主要有Avelumab、At-ezolizumab和Durvalumab，均处于Ⅰ期或Ⅱ期试验（NCT02519348）。 EL-KHOUEIRY AB, SANGRO B, YAU H, et al. Nivolumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma (CheckMate 040): An open-label, non-comparative, phase 1/2 dose escalation and expansion trial［J］. Lancet, 2017, 389(10088): 2492-2502. 关于自噬调节CTLA4进而影响肿瘤免疫逃逸的研究尚未报道。CTLA4介导的免疫逃逸机制是表达于活性T淋巴细胞表面的CTLA4可以与配体B7结合使T淋巴细胞活性受到抑制，肿瘤产生免疫逃逸。针对肝癌的CTLA4抗体主要有ipilimumab和tremelimumab，目前均处于临床试验中（NCT02519348、NCT0100835854I），但相比于PD-1抗体的研究，CTLA4抗体的安全性、耐受性等研究仍浅。 2 过继免疫细胞治疗 过继免疫细胞治疗是指将具有抗肿瘤效应的自体或异体细胞在体外进行诱导、激活或修饰并扩增后回输给肿瘤患者，再转移到病灶，以达到治疗及预防复发之目的，常用的过继细胞有细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）以及基因修饰T淋巴细胞。自噬可促进自然杀伤细胞（NK细胞）成熟，并调节NK细胞内部稳态和抗肿瘤作用，且自噬可通过细胞因子途径或ROS途径调控T淋巴细胞胞内稳态、免疫功能及记忆T淋巴细胞的产生等，故理论上来说自噬在该治疗中影响较大，但可能该治疗现开展较少，尚未有针对自噬的药物联合其治疗肝癌的研究报道。 针对肝癌的CIK过继免疫细胞疗法的Ⅲ期试验已经展开。一项韩国的研究显示，肝癌常规治疗（手术、射频消融、化疗）后导入经活化的CIK治疗（包括表达CD3+CD56+T淋巴细胞和CD3+CD56-T淋巴细胞及CD3-CD56+NK细胞）可明显提高230例患者的无复发生存率和总生存率（NCT00699816）。 一项纳入17例TIL治疗肝癌的 Ⅰ 期试验结果显示：2例患者未检测到TIL扩增，在14个月的中位生存期后3例患者复发，其余12例未见肿瘤复发，且该试验中TIL表现出了低毒性。 嵌合抗原受体T淋巴细胞(CART)免疫疗法是过继免疫细胞疗法使用基因修饰T淋巴细胞中的一种，其在淋巴系统恶性肿瘤治疗中取得了卓越的成效，在肝癌治疗中的研究正在开展。一项修饰后定向CD133的CART治疗的Ⅰ期试验中，纳入的23例患者包括14例肝癌患者，7例胰腺癌患者，2例结直肠癌患者，体现了CART-CD133在治疗CD133+肿瘤患者时具有稳定的疗效，尤其是针对晚期转移患者，且毒性在可控范围内。 针对肝癌的过继免疫细胞疗法现仍需深入研究，自噬在该疗法中的影响研究尚未报道，但鉴于自噬对免疫细胞稳态维持及功能调控的重大影响，探究自噬在其中的机制可能能为这方面的研究提供一个方向。 3 肿瘤疫苗 目前，预防肝癌发生或肿瘤进展的疫苗研究正在开展，其中已报道过自噬在其中产生影响的疫苗有自噬相关基因疫苗、DC疫苗、病毒疫苗和肿瘤抗原疫苗。 如前所述，自噬在早期阶段主要起抑制肝癌发生作用，但在后期发展、侵袭和转移过程中则主要起促进作用，有研究表明针对自噬配体蛋白p62的编码DNA的疫苗可以有效抑制肝癌的发展和转移，但该实验仅停留在狗、大鼠和小鼠模型，仅在大鼠模型中进行了最小毒性剂量的测定。 使用肿瘤细胞源自噬体刺激DC产生的疫苗研究表明，相比于仅接种DC疫苗的肝癌小鼠模型，接种肿瘤细胞源自噬体刺激获得的成熟DC疫苗的小鼠出现明显的特异性T淋巴细胞反应，抗肿瘤效应显著，肿瘤生长明显受到抑制。 自噬在HBV相关HCC的发生发展中起重要作用，且与HBx关系密切，一项关于携带HBx表达基因的腺病毒载体疫苗的研究表明，该疫苗可使肝癌细胞表达HBx，并通过自噬途径诱发增强CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的抗肿瘤免疫效应。 有研究表明，肝癌的特异性抗原AFP在肝癌细胞中抑制细胞自噬和细胞凋亡，进而促进肿瘤增殖转移，其机制可能是通过PI3K/Akt/mTOR途径。一项AFP衍生的疫苗I期试验中，纳入15例肝癌患者，观察期为730 d，5例患者检测到了明显的免疫应答反应，8例患者病情维持稳定，肿瘤增长速度减缓，无不良事件发生（UMIN000003514）。 疫苗是预防肝癌发生或肿瘤进展较为经济有效的方式，上述几种疫苗都与自噬关系密切，故明确自噬在其中的具体机制可能有益于新疫苗的研发，可能为肝癌预防提供潜在的靶点。 4 其他治疗 针对肝癌的免疫治疗还包括特异性抗体治疗，主要原理是介导抗体依赖的细胞毒作用。CD147在肝癌肿瘤边缘高表达，并介导肿瘤增殖，多克隆抗体HAb18可以特异性识别，基于此原理，有研究设计了一种可以表达HAb18和具有肿瘤杀伤效应的细胞因子IL-24的溶瘤腺病毒（自身表达ZD55），实验发现ZD55- HAb18- IL24可通过诱导细胞凋亡和细胞自噬抑制肝癌细胞生长，且效果比单一使用抗体好。还有研究表明，一种携带TSLC1抑癌基因的溶瘤腺病毒可靶向Wnt信号通路使肿瘤细胞发生细胞自噬、凋亡等从而抑制肿瘤生长，可延长小鼠模型的生存期，该研究则从基因层面调控了肿瘤代谢。 自噬在肝癌的发生发展中发挥重要作用，但其影响呈双面性。自噬的诱导和抑制在肝癌免疫治疗中均取得了一定进展，但其作用机制并不完全明确，取决于很多因素，可能和肝癌的分化、病程分期等有关。并且，自噬的调控机制在肝癌发生发展的不同阶段可能起到不同的作用，如何调控自噬，减少肝癌发生，并且促进细胞进入自噬死亡程序，已经成为肿瘤预防和治疗研究的新热点。 引证本文：王沐淇, 李亚萍, 刘拉羊, 等. 自噬在肝细胞癌发生发展和免疫治疗调控中的作用及其机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(5): 1129-1134. |
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