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首都医科大学附属北京妇产医院 AP中的自噬过程发生改变 自噬受损主要表现为自噬流动态过程的完整性受损，可发生在自噬任何步骤，包括自噬体的形成减少或产生缺陷、与溶酶体融合发生障碍，或溶酶体蛋白水解酶活性功能低下。许多疾病都与自噬损伤有关，例如克罗恩病中自噬蛋白ATG16L1突变引起自噬体形成缺陷，与炎症持续发生关系密切。 自噬早期（自噬体与溶酶体融合之前）和晚期（自噬体与溶酶体融合及之后）受损对细胞内自噬泡数量产生相反的影响。早期抑制会引起自噬泡形成数量减少；而晚期抑制则会导致自噬体与溶酶体融合障碍，胞内自噬体数量堆积，溶酶体内蛋白酶活性也将受损，导致含有待降解物质的自噬溶酶体积聚。研究发现AP中的自噬过程发生显著改变。 2.1 AP中自噬受损 胰腺腺泡细胞中大液泡的积聚是人和实验性AP的突出特征，研究发现大多数的液泡都是自噬相关的。在腺泡细胞中AP时产生的液泡比饥饿刺激更多，而这些液泡也明显更大；此外，AP的自噬液泡主要是自噬溶酶体。在多种AP模型中观察到，大液泡的积累伴随着LC3-Ⅱ水平的增加，与饥饿相比，AP大大降低了自噬效率，主要表现为长寿蛋白降解率降低和通过自噬途径降解的泛素化蛋白受体p62（也称SQSTM1）水平提高。液泡积累、自噬降解效率降低，以及LC3-Ⅱ和p62水平的提高，揭示了AP的自噬受损。此外，载着部分消化的待降解物质的巨自噬溶酶体占主导地位，表明溶酶体水解活性受到损害。AP并不能阻止自噬体与溶酶体的融合，这一点体现在腺泡细胞中自噬溶酶体数量积聚，及与溶酶体共定位的标志物LC3-Ⅱ增加。而长期基础水平自噬受损将会导致慢性胰腺炎的形成。 2.2 AP对自噬体生成的影响 胰腺炎并不能阻止自噬体的生成；与此相反，Gukovsky等发现自噬介导蛋白——液泡膜蛋白1在AP中是上调的。液泡膜蛋白1与腺泡细胞中的自噬诱导有关，主要存在于内质网中，为AP表达上调的蛋白质之一。它与自噬起始相关蛋白Beclin1相互作用，与LC3-Ⅱ能共定位，是自噬体生成的重要介质。透射电镜和免疫电镜显示自噬液泡具有自噬体的所有特征，如双膜、LC3-Ⅱ和完整的大降解物质。遗传、分子和药理学表明腺泡细胞中Atg5参与到自噬体的生成，表明自噬体形成是通过规范途径进行的。 2.3 AP中自噬体与LAMP减少 细胞腔面有多蛋白复合物保护LAMP在空间上与溶酶体酸性水解酶分离，以及其高度糖基化，避免了被裂解。多项研究发现AP中LAMP表达显著减少，其降解并非由于去糖基化导致，而是通过组织蛋白酶（cathepsin, Cat)B介导的胞浆面近跨膜区域的断裂 。研究推测，CatB的异常成熟使其在AP溶酶体中定位发生了改变，并与其他水解酶共同作用，导致LAMP发生降解。 研究发现，LAMP的缺乏也能导致AP。在LAMP-2基因敲除的小鼠胰腺中，胰腺腺泡细胞中形态异常的自噬泡的显著聚集早在小鼠1个月大时便很突出，并且与进行性胰腺腺泡细胞损伤有关。 2.4 AP中溶酶体酶活性异常介导了自噬溶酶体功能损伤 20多年前，Steer发现，实验性AP导致了CatB活性显著降低。在AP中组织蛋白酶加工受损，导致了成熟形态的减少，而以中间体和前体形式聚集增多。溶酶体组织蛋白酶的发育不全意味着激活缺陷，从而解释了AP中溶酶体酶活性下降。Mareninova等发现这种下降并不局限于CatB，还发生在溶酶体水解酶CatL、CatD、天冬酰胺内肽酶（或半胱氨酸蛋白酶）、芳基硫酸酯酶等，提示AP时溶酶体内酶功能活性普遍下降。 Boonen等研究发现，功能失调的溶酶体水解酶，特别是组织蛋白酶，会引起小鼠腺泡细胞的自噬损伤。glcnac-1-磷酸转移酶由Gnptab和Gnptg基因编码亚基，将修饰性M6P加到溶酶体的酸性水解酶上，这是水解酶的一种特异性识别信号，可将水解酶靶向转运至溶酶体上。Gnptab基因敲除阻断了组织蛋白酶从高尔基体到溶酶体的转运，小鼠胰腺外分泌部溶酶体降解能力显著下降，导致腺泡细胞自噬功能受损，表现为大量体积异常增大的含有未消化待降解物质的自噬体堆积。 3 自噬功能异常在AP疾病发生发展中的作用 胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原异常激活与炎症反应是胰腺炎疾病发生发展的重要机制，而自噬与二者皆密切相关。 3.1 自噬受损与腺泡细胞内胰蛋白酶原激活 小鼠AP模型中，已确定了AP与自噬受损之间存在一定的关联。这种自噬受损反应与细胞内胰蛋白酶原激活有关。 Hashimoto等首次利用Atg5基因敲除小鼠建立AP模型，发现Atg5基因敲除后小鼠胰腺腺泡细胞自噬减少、胰蛋白酶原活性明显降低、病情严重程度减轻。Mareninova等研究发现，AP并不能阻断自噬体与核内体/溶酶体的融合，但是能导致溶酶体关键酶CatL与CatB的加工（成熟）障碍，使得AP中组织蛋白酶向不成熟的形式倾斜，这种损伤可能是导致溶酶体清除蛋白功能不全及自噬流受损的重要原因。CatB能将胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶，但CatL并不会激活胰蛋白酶原，相反，会降低胰蛋白酶和胰蛋白酶原。CatL与CatB平衡失调导致胰腺腺泡细胞中胰蛋白酶上调，而胰蛋白酶原激活被认为是AP发病的主要机制。然而，胰蛋白酶原基因敲除的小鼠仍然易发生AP，尽管腺泡细胞的损伤受到一定的保护作用，即胰蛋白酶激活并不是AP启动的必须条件。 3.2 自噬受损与炎症反应 研究发现，自噬有直接清除微生物（微生物入侵、刺激固有免疫反应，如上调Toll样受体的表达，诱导自噬反应，吞噬微生物至溶酶体中降解、控制炎症和抗原反应（自噬能够通过清除受损线粒体、抑制炎症小体的激活；自噬过程一旦受损，促炎介质将发生清除障碍）、淋巴细胞稳态（自噬能够通过调节细胞内主要组织相容性复合体抗原递呈、IL-1α等调控淋巴细胞的平衡及功能）及免疫介质的分泌（自噬能够通过调节分泌性蛋白合成途径、胞质中分泌性蛋白数量控制免疫介质的分泌）等免疫学功能。炎症反应各阶段的许多分子均受核因子-κB(NF-κB)调控，包括TNFα、IL-6、iNOS、趋化因子等。Yang等研究发现，NF-κB活化增强胰腺腺泡细胞自噬。通过抑制重症急性胰腺炎胰腺腺泡细胞自噬，能够减轻炎症反应及胰腺炎的严重程度。上述研究提示AP中自噬与炎症反应密切相关。 3.3 假说 溶酶体/自噬功能异常是AP启动的关键起始事件。Gukovskaya等提出溶酶体/自噬功能障碍是AP的关键启动事件。在人和所有动物模型中，AP均出现明显的自噬受损现象。溶酶体/自噬功能异常是疾病发展的早期事件。例如，溶酶体组织蛋白酶活性的抑制、LAMP的减少以及自噬功能受损在雨蛙素诱导的AP中30 min即出现，与AP的其他早期病理学反应如胰蛋白酶原和NF-κB激活同时出现。 专门针对溶酶体或自噬功能的基因改变会引发类似于AP的损伤。在LAMP-2缺乏、溶酶体/自噬功能异常的小鼠引起自发性胰腺炎，表现有胰腺腺泡细胞空泡化、胰腺内进行性炎性浸润和腺泡细胞坏死。在Gnptab基因敲除、组织蛋白酶运输至溶酶体受阻的小鼠中，自噬流受损，导致胰腺炎反应，如腺泡细胞空泡化、炎症和胰腺组织结构紊乱。2种M6P受体中的一种被敲除，可能会加强雨蛙素诱导的胰腺炎中的胰蛋白酶原的激活。 4 干预自噬探索AP治疗潜在靶标 Wan等发现自噬早期抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA）和诱导剂雷帕霉素可干扰自噬过程，调节NF-κB和caspase-1-IL-1β通路，减轻雨蛙素和左旋精氨酸诱导的BALB/c小鼠重症AP模型中炎症因子水平和多器官损伤。AP体外模型研究发现，miRNA可从基因水平调节溶酶体蛋白（LAMP-2和组织蛋白酶）的表达，调节胰腺腺泡细胞自噬过程，影响胰酶的激活。传统中药治疗AP自古已有，且疗效明确。研究发现，五加属、大黄素等中药制剂，也能通过调节牛磺胆酸钠诱导的大鼠AP模型胰腺腺泡细胞受损自噬，减轻炎症和胰腺炎严重程度。对自噬过程各个环节的干预，能够影响AP中炎症通路和胰酶激活，进而干扰胰腺炎发生发展进程，对临床探索治疗AP潜在靶标具有重要的启示意义。 5 展望 目前，对自噬功能障碍调控机制的理解中仍存在着许多空白。自噬在AP的起始事件中具体扮演什么样的角色（是自噬诱导了AP，还是AP导致自噬异常）尚无研究结论。NF-κB途径作为胰腺炎机制的一个重要参与者，引发炎症反应，但目前为止自噬与NF-κB路径之间的联系尚未阐明。AP中引起腺泡细胞中溶酶体/自噬功能异常的具体机制尚不明确。是否有其他途径导致溶酶体退化（例如vATPase的病理改变导致的溶酶体内pH值的变化）、组织蛋白酶在胰腺炎的病理作用、是否存在其他溶酶体水解酶的参与以及胰腺炎的LAMP降解机制是什么等关键问题，均有待进一步的探究。 阐明自噬功能障碍的分子机制将有助于深入了解治疗AP或减轻其严重程度的潜在分子靶标。面临的挑战将是如何使这些途径“正常化”，使紊乱的自噬通路恢复，发挥其积极的作用，而不是简单地刺激或阻止自噬。由于溶酶体的降解存在缺陷，刺激AP的自噬可能会加剧细胞内代谢通路的紊乱。这也许可以解释为什么通过敲除Atg5基因（或siRNA）或3-MA来抑制自噬，能够起到改善雨蛙素诱导的AP的作用。然而，长期的自噬抑制对于机体来说可能是有害的，即AP的后期恢复阶段。 引证本文：李春云, 刘瑞霞, 阴赪宏. 自噬在急性胰腺炎发生发展中的作用[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(5): 1157-1160. |
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