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众所周知，病毒性病害迄今为止都没有有效的杀菌剂可以防治，历来被视为植物病害中的绝症。病毒性病害一旦发生，不仅造成严重的产量和品质损失，也因频繁用药防治带来食品安全的更大风险。令人振奋的消息来了！有人发现了攻克病毒性病害的新方法！！！接下来，小编为您奉上这篇论文的中文版，这是由金敦福技术中心翻译的，由于翻译水平有限，错漏之处，敬请指正！（论文篇幅较长，如果您时间宝贵，可以跳过引言、统计分析和材料与方法，直接阅读结果、讨论和结论部分） Trichoderma harzianum T-22 Induces Systemic Resistance in Tomato Infected by Cucumber mosaic virus哈茨木霉T-22诱导黄瓜花叶病毒感染的番茄产生系统抗性Antonella Vitti1, Elisa Pellegrini2*, Cristina Nali2, Stella Lovelli1, Adriano Sofo1, Maria Valerio1, Antonio Scopa1 and Maria Nuzzaci1 1School of Agricultural, Forestry, Food and Environmental Sciences, Università degli Studi della Basilicata, Potenza, Italy 2Department of Agriculture, Food and Environment, University of Pisa, Pisa, Italy 由于化学防治无效，所以了解使用生物制剂诱导植物防御病毒的能力对于制定病毒防治新策略至关重要。哈茨木霉菌株T-22（T22）能够防治番茄（Solanum lycopersicum var. cerasiforme）中黄瓜花叶病毒（CMV）以及用T22/CMV处理/感染的番茄的生理变化已有研究，对植物的促生长作用、光合性能、活性氧清除酶和植物激素的影响也已有研究。T22能够促进番茄在株高方面的生长，并能改善光合作用、总叶绿素含量和植物气体交换。相反，CMV对番茄的干物质积累产生不利影响，并抑制光合能力。植物激素的分析表明，在CMV感染之前或同时进行T22处理，会导致茉莉酸（JA/乙烯（ET）和水杨酸（SA）信号途径产生的系统抗性。相反，在CMV感染之后用T22处理，番茄产生的系统抗性是脱落酸（ABA）途径。总之，此报告的数据表明基于T22的CMV防治策略可能是最有效措施。病毒显著干扰植物生理过程的能力与一系列病症密切相关。CMV（Bromoviridae科, Cucumovirus属）是所有RNA病毒中宿主范围最广的植物病毒（Edwardson and Christie, 1991），能够引起多种症状，如黄斑、扭曲和生长停滞，这会导致严重的经济损失（Whitham et al., 2006）。CMV基因组RNA2编码病毒的2b蛋白，该蛋白是病毒重要毒力的决定因素，并且还负责（1）干扰植物的防御途径和（2）抑制SA和JA介导的抗性（Mochizuki and Ohki, 2012）。作为对病害的一种反应，植物通常可以补偿广泛的细胞过程：（1）上调或下调特定基因；（2）改变涉及植物防御途径的各种物质（例如活性氧ROS的水平）；（3）激活特定转录因子、防御调控基因和热激蛋白；（4）增强大分子、酶和涉及防御信号途径的各种植物激素（SA、JA、ET、IAA、CTK、ABA和GA）的运输（Bari和Jones，2009；Vitti等，2013）。木霉菌是著名的生防制剂（BCA），它们能够拮抗植物病原体（Benítez et al., 2004; Harman, 2006），能够诱导植物对病原体的防御反应，并有利于植物的生长和发育（Harman et al., 2004），并通过对植物基因表达进行重新编码来提高光合作用效率和呼吸活性（Shoresh et al., 2010）。Mastouri等（2010）证明，用T22处理番茄种子时，可以缓解一系列生物和非生物胁迫。这是因为在根部定殖后，木霉能够与植物进行化学通讯，有时它们会充当内生共生体。所以，它们能够正确调控各种植物基因的表达以及作为基因表达结果的各种植物生理学变化（Harman et al., 2012）。迄今为止，关于木霉菌诱导植物防御病毒的信息很少（Lo et al., 2000; Luo et al., 2010; Elsharkawy et al., 2013）。另外，据我们所知，目前尚无关于在植物-病毒的病理系统中用木霉菌处理后的植物生理变化的研究。先前已经通过分析植物-病毒相互作用中涉及的各种生化的和分子的指标研究了T22诱导番茄防御CMV的作用，并证明ROS有明确参与（Vitti et al., 2015）。为了研究植物、病毒和拮抗剂之间这种复杂的三方互作机制，本文彻底分析了木霉菌对植物生长的促进作用、对植物光合性能的影响以及ROS清除酶和激素在番茄-CMV-T22互作调控中的作用。T22防御CMV感染的可能性，对推动整体理解植物-病原体-BCA复杂关系并制定合理策略来管理病毒性病害，都至关重要。哈茨木霉菌株T-22采用科伯特（Koppert，Berkel en Rodenrijs, The Netherlands）的颗粒型商业制剂Trianum G，黄瓜花叶病毒菌株Fny（CMV-Fny）经纯化后使用。具体细节参见Vitti等（2015）的文章。在开始试验之前，对商业制剂按如下步骤进行控制和表征：在无菌水中对Trianum G颗粒进行连续稀释（同样稀释，并在121°C高压灭菌20分钟）。将获得的每种悬浮液的等分试样散布在固体基质（PDA + Agar）上和两种液体基质（PDA和NaCl溶液）中，并在25°C下培养3至5天。分离和表征显示Trianum G颗粒上仅存在T22，而高压灭菌后则完全没有。同时，将T22定殖于在三种不同基质（琼脂营养培养基、砾石和无菌土壤）上生长的番茄幼苗的根部，并检查和检测到了定殖。为了尽可能接近田间条件，选择使用土壤栽培幼苗，且在整个研究过程中也检查确认了定殖。以上为本研究的起点。表面灭菌（用1%次氯酸钠溶液灭菌1分钟）后，番茄（Solanum lycopersicum var. cerasiforme cv. Cherry）种子置于铺有用水湿润的滤纸的无菌培养皿中，在26°C条件下培养2-3天，以使其发芽。发芽一天后，将幼苗移栽至填充灭菌土壤的盆中，放置于光周期为16h的人工培养室中，温度为26/23°C（昼/夜），并用如前（Vitti et al., 2015）所述的强度为1/4的Hoagland营养液浇水。T22处理是按照生产商建议使用方法和剂量将Trianum G颗粒混入栽培基质（750 G m-3）中。在4叶期，用纯化的CMV-Fny对番茄植株进行机械接种（5μg子叶-1）。根据以下六种处理要求（每种处理25株）对植株进行T22处理和/或CMV接种：未经处理的健康对照（PA）；仅用T22处理（PB）；仅接种CMV（PC）；先用T22处理再在7天后接种CMV（PD）；同时用T22处理和CMV接种（PE）；先接种CMV再在7天后用T22处理（PF）。接种CMV14天（即植株1个月龄）后，和到植株3个月龄时，收集组织材料并用于以下分析。根据Murphy等人（2003）的研究，当植物分别为1个月龄和3个月龄时，使用0-10评分制评级量表测量病害严重程度：0 =无症状；2 =叶片上出现轻微的花叶症状；4 =叶片上出现严重花叶症状；6 =叶片出现花叶和变形；8 =叶片出现严重花叶和变形；10 =叶片出现严重花叶和变形并生长停滞。病害严重程度分值为每种处理的25个采样的平均值。2.4 用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测CMV当植物分别为1个月龄和/或3个月龄时，从每种处理的25株植物中随机选择4株收集叶片样品。双抗体夹心（DAS）酶联免疫吸附测定（ELISA）法按如下步骤进行：用200μl/孔的特异性抗CMV一级抗体（Bioreba, Reinach, Switzerland）以1:1000比例稀释于包被缓冲液中来包被平板（Bioreba），然后在37°C下培养2小时。用含有0.05％吐温20的PBS（洗涤缓冲液）洗涤平板3次。将在提取缓冲液（Bioreba）（1:10，w：v）中的粗制植物提取物添加到每个孔中（200μl），并在4°C下保持过夜。用洗涤缓冲液（Bioreba）将平板洗涤3次。将偶联至碱性磷酸酶的抗CMV免疫球蛋白在偶联缓冲液中以1：1000稀释（Bioreba），并添加至平板中（200μl/孔）。平板在37℃下培养2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤3次。将对硝基苯基磷酸酯以1 mg ml-1的浓度溶于底物缓冲液（Bioreba）中，并向每个孔中添加200μl。在室温下黑暗中进行反应。用酶标仪（Bio-Rad，型号550，Hercules，CA，USA）读取OD405nm处的吸光度，取每个样品四次重复的平均吸光度值。试验结束时，从每种处理的25株植物中随机选择3株收集叶片样品，取叶片的中心部分，用10毫升N,N-二甲基甲酰胺从叶盘（直径8毫米）中提取叶绿素，然后在647nm和664nm进行分光光度分析（型号SP8001，Metertech，台湾，中国）。用Moran（1982）报告的公式计算叶绿素a（chla）和叶绿素b（chlb）的含量。试验结束时（3个月龄植株）考虑了植株生长参数的测定。测量了株高，并通过在75°C的通风烘箱中干燥样品直到恒重来获得干物质重量（地上部分，DM）。所有处理均取三株植物的测定值（从每种处理的25株植物中随机选择）。在所有6种处理中，从每种处理的25株植株中随机选择3株，在其顶端成熟且无症状的叶片上，对2个月龄和3个月龄植株的光合活性（A）、水蒸气气孔导度（gs）和细胞间CO2浓度（Ci）进行了测定。在分析之前，将选定的植物放置于温度为28.4／18.1±0.2°C（昼/夜）人工培养室中，植物所在高度的光合有效辐射（PAR）为700～800μmol光子m-2 s-1（以高压钠灯和卤素灯共同提供），光周期为 13小时。使用配备有2cm-2腔室和6400-6440 LED光源的LI-6400型便携式光合作用系统进行测量，该系统在380ppm的环境CO2浓度下工作。在测量过程中，反应杯的湿度和温度保持恒定，以维持恒定的空气蒸汽压差。在饱和光照条件下（PAR约为1500μmol光子m-2 s-1）于12:00和14:00（太阳时间）进行分析。在控温的培养室内（28–30°C），将叶片温度保持在接近空气温度的水平下进行测量。当植株1个月龄时，测定了超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）和过氧化氢酶（CAT，EC 1.11.1.6）的酶活性。关于SOD提取，将采集自3株植物（从每种条件下的25株中随机选择）的冷冻叶片（1 g）置于5 ml冷却的20 mM HEPES缓冲液（pH 7.2，含有1 mM EGTA、210 mM甘露醇和70mM蔗糖）中匀浆，然后在4°C下以1,500×g转速离心5分钟。弃去沉淀物，并将上清液在4℃下以10,000×g转速再次离心15分钟。所得上清液包含胞质SOD（cyt-SOD）和沉淀线粒体SOD（mit-SOD）。线粒体沉淀物在前面使用的冷却缓冲液中匀浆。根据生产商的说明，使用Bio-Rad 550型酶标仪（Superoxide Dismutase Assay Kit, item No.706002; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA）在450 nm处监测cyt-SOD和mit-SOD的吸光度。SOD的一个单位定义为显示50％超氧化物歧化所需的酶量。关于CAT的活性，将采集自3株植物（从每种条件下的25株中随机选择）的冷冻叶片（1 g）在5 ml冷却的50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0，含1 mM EDTA）中匀浆，然后在4°C下以10,000×g转速离心15分钟。弃去沉淀，并将所得上清液用于后续步骤。根据生产商的说明，使用Bio-Rad 550型酶标仪（Catalase Assay Kit, item No. 707002; Cayman Chemical）在540 nm处读取酶产物的吸光度。CAT的一个单位定义为在25℃下每分钟生成1.0nmol甲醛所需的酶量。从每种处理的25株植物中随机选择3株1个月龄植物，采集叶片和根样品，用于ET、ABA、SA和JA的测定。关于ET的产生，在切除（将叶片自叶柄下几毫米处切下，将12–16个根尖切成5mm小块）后15分钟，将材料封入气密容器（250 ml）中。在22°C下培育1小时后，从容器顶部空间取2 ml气体样品。ET浓度通过气相色谱仪（HP5890, Hewlett-Packard, Ramsey, MN, USA）检测，该气相色谱仪使用火焰离子化检测器（FID），不锈钢柱装有Hysep T，内径为150 cm×0.4 cm，检测器温度分别为70°C和350°C，以30 ml min-1的流速输送N2载气（Pellegrini et al., 2013）。对照外标进行定量。ABA根据Perata等人（1997）的方法测定。将冷冻的叶片和根样品（150 mg）在0.8 ml 100％HPLC级水中匀浆，并在4°C下培育过夜。超声处理和离心（在4°C下以16,000×g转速离心10分钟）后，将上清液用0.2μm Minisart SRT 15过滤器过滤并立即进行分析。在室温下用反相Dionex色谱柱（Acclaim 120，C18，粒径5μm，内径4.6 mm，长度150 mm）进行HPLC分离。混合物前6分钟用70％溶剂A（0.05 M酸化水）和30％溶剂B（甲醇）洗脱，然后用50％溶剂B线性梯度洗脱2分钟，再用50％溶剂B洗脱18分钟，接着用100％溶剂B线性梯度洗脱2分钟，再用100％溶剂B洗脱2分钟，最后再用70％溶剂A线性梯度洗脱2分钟。流速为1 ml min-1。在254nm吸光度下检测ABA。为了定量ABA含量，将已知量的纯标样注入HPLC系统，获得关联峰面积与ABA浓度的方程。根据Pellegrini等人（2013）的方法并做一些修改，测定结合和游离SA。将冷冻的叶片和根样品（150 mg）添加到1 ml的90％（v / v）甲醇中，涡旋振荡并超声处理3分钟。在室温下以10,000×g转速离心10分钟后，转移上清液，然后将沉淀物在0.5 ml的100％（v / v）甲醇中再次萃取，然后如上所述进行超声处理和离心。合并两次提取的上清液，并在40℃下真空蒸发。将残余物重悬于0.25ml的5％（w / v）TCA中，并通过使用0.8ml的乙酸乙酯/环己烷的1:1（v / v）混合物分配两次。将含有游离SA的上层相在真空下于40°C浓缩，将含有结合SA的下层液相通过添加0.3 ml的 8 M HCl在80°C下培育60分钟来水解。将从上层相收集的和从下层相回收的两种SA合并，并溶解于600μl的流动相中，该流动相包含0.2 M乙酸钠缓冲液、pH5.5（90％）和甲醇（10％）。用上述Dionex柱在室温下进行HPLC分离。SA用荧光定量法（RF 2000 Fluorescence Detector, Dionex, Sunnyvale, CA, USA）定量，在305nm处激发，在407nm处发射，并使用上述流动相洗脱。流速为0.8ml min-1。为了定量SA含量，将已知量的纯标样注入HPLC系统，获得关联峰面积与SA浓度的方程。茉莉酸根据Pellegrini等人（2013）的方法测定。将冷冻的叶片和根样品（150 mg）添加到1 ml乙酸乙酯中，并在4°C下培育过夜。将提取物在4°C以10,000×g转速离心10分钟。加入0.2％（v / v）酸化水的混合物后，将液相过滤并立即使用上述Dionex柱进行HPLC分析。在210nm吸光度下检测JA。流速为1 ml min-1。为了定量JA含量，将已知量的纯标样注入HPLC系统，获得关联峰面积与JA浓度的方程。在两次重复实验中，每次生态生理/生化分析均从每种处理的25株植物中随机选择至少3株。在进行Shapiro-Wilk W检验后，使用重复测量（在两个时间点进行测量的情况下，即生态生理参数和病害严重程度）或单因素和双因素方差分析（ANOVA）方法，对数据进行分析。均值之间的比较是用Fisher最小显著性差异法（LSD）检验确定的（P≤0.05）。所有分析均采用NCSS 2000统计分析系统软件（NCSS, Kaysville, UT, USA; see Hintze, 2001）。接种后的十四天期间，PC一直显示出严重的花叶和变形，且大多生长迟缓（图1A）。这些症状持续到植株3个月龄，其叶片也表现出由CMV-Fny诱导的典型坏死（图1B）。在所有用T22处理的三个处理（PD、PE和PF）中，始终有显著的症状改善，尤其是在植株3个月龄时。图1C显示了病害的严重程度。处理和时间之间的相互作用以及单独的因素影响均很显著（根据重复测量的ANOVA，P <0.001）。PC组的病害严重程度平均起来显著高于也用T22处理的各个组合处理组，尤其是在株龄较大的植株上（PD、PE和PF分别为–74、–75和–82％），以及PF组1月龄植株上（比PC低约2倍）（图1C）。 图1 用或不用T22处理的CMV诱导的番茄病害严重程度（0-10级）及其在1月龄（白柱）和3月龄（灰柱）番茄中的积累。（A，B）分别为1月龄或3月龄番茄的整个植株或叶片的一个代表。（C）病害平均严重程度等级（n = 25）和（D）通过ELISA方法在OD405 nm处获得的平均吸光度（n = 4）。柱形代表均值的标准误差。不同小写字母表示用重复测量（C）和双因素ANOVA（D）方法评估处理和时间之间的显着差异（P≤0.05）。PA，健康对照；PB，仅用T22处理；PC，仅接种CMV；PD，先用T22处理，一周后接种CMV；PE，同时用T22处理和CMV接种；PF，先接种CMV，一周后用T22处理。CMV在系统感染的叶片中的积累通过ELISA测定（图1D）。根据双因素方差分析，处理和时间之间的相互作用以及独立因素的影响均显著（P<0.001）。那些既接种CMV也用T22处理的较年轻的植株，平均吸光度值相对于PC有显著差异，尤其是PE和PF（分别为–24和–29％）。此外，在植株3月龄时进行测试，PD、PE和PF的平均吸光度值显著低于PC（分别为15倍、26倍和170倍）。但是，在3月龄的PE和PF之间以及PA和PB之间均未观察到显著差异（图1D）。健康对照（PA）以及仅用T22处理的植物（PB）均无症状，并且ELISA的CMV检测结果为阴性，且与叶龄无关。如图2和补充表1所示，仅用T22处理的PB组，总叶绿素含量、Chla和Chlb最高，而单用CMV接种的PC组最低。根据单因素方差分析（P = 0.001），T22和CMV组合使用组（PD、PE和PF）与PA组无统计学意义的差异。图2. 用或不用T22处理、接种或不接种CMV的3月龄番茄植株中总叶绿素（Chltot）含量。柱形代表平均值的标准误差（n = 3）。不同小写字母表示通过单因素方差分析评估的处理组间存在的显着差异（P≤0.05）。PA，健康对照；PB，仅用T22处理；PC，仅接种CMV；PD，先用T22处理，一周后接种CMV；PE，同时用T22处理和CMV接种；PF，先接种CMV，一周后用T22处理。单因素方差分析（P <0.001）突出显示，PD、PE和PF三种处理，相对于PA和PC，用T22处理总是导致株高的显著增加（大约比PA高1.2倍），尤其是PF组（+ 11％），如图3A所示。另一方面，地上DM不受T22处理的影响（图3B）。单因素方差分析（P <0.001）表明，在单独用T22处理（PB）以及随后（PD）或同时（PE）接种CMV的植物中，DM与PB组在统计学上没有差异。单独（PC）或在T22处理之前接种CMV（PF）的植物，DM显著低于PD（PC较PD–35％，PF较PD–24％）和PE处理（PC较PE–52％，PF较PE–39％）。观察发现PC和PF组DM与PA相比平均减少了33％。图3. 用或不用T22处理、接种或不接种CMV的3月龄番茄植株的生长参数。（A）株高，（B）地上干物质（n = 3）。不同小写字母表示通过单因素方差分析评估的处理之间存在的显著差异（P≤0.05）。柱形代表均值的标准误差。PA，健康对照；PB，仅用T22处理；PC，仅接种CMV；PD，先用T22处理，一周后接种CMV；PE，同时用T22处理和CMV接种；PF，先接种CMV，一周后用T22处理。关于A值（光合活性），处理和时间之间的相互作用是显著的（P = 0.043），独立因素也是如此（处理P <0.001，时间P = 0.002）（根据重复测量方差分析，表1）。在2月龄植物中，与PA相比，PE组A值增幅最大（+ 17％）。无论植物年龄如何，在单独感染CMV的植物中（PC）检测到的A值最低。3个月后，除PC和PD外，由于叶片衰老开始，所有处理组均观察到A值普遍下降；此时，PB、PD和PE组A值较高，而PF与PA相同。3月龄的PD、PE和PF组A的平均值显著高于PC组平均值（分别+59％、+ 60％和+ 33％）。关于gs值（水蒸气气孔导度），处理与时间之间的相互作用是显著的（P = 0.039），独立因素亦如此（处理P = 0.001，时间P = 0.041）。在2月龄的PC组，gs非常低（与PA和PB相比约–40％）。3个月后，除PF外，所有处理均观察到gs普遍升高。表1. 用或不用T22处理、接种或不接种CMV的2月龄和3月龄番茄植株的叶片气体交换参数 对于每一个参数（列中的一对），不同小写字母表示用重复测量方差分析评估的处理和时间之间的显著差异（P≤0.05）。数据以均值±标准误（n=3）的形式表示。PA，健康对照；PB，仅用T22处理；PC，仅接种CMV；PD，先用T22处理，一周后接种CMV；PE，同时用T22处理和CMV接种；PF，先接种CMV，一周后用T22处理。A，光合活性；gs，水蒸气气孔导度；Ci，胞间CO2浓度。关于Ci值，处理和时间之间的相互作用很显著（P = 0.022），独立因素影响也是如此（处理P = 0.005，时间P = 0.031）。2月龄PC组的Ci值最低，而所有其他处理组均明显高于PC组，且彼此之间没有差异。相反，在3月龄时，PC、PD、PF组的Ci值与健康对照（PA组）的Ci值无统计学差异，而PB和PE显著低于PA（分别–24%和-17％）和PC（分别– 29%和–22％）。单因素方差分析（P <0.001）显示，总SOD活性PE组最低，PA组最高（图4A），PF组显著低于PA（–11％），但与PB组无显着差异。除PB外，cyt-SOD活性的趋势与总SOD活性的趋势平行。另一方面，mit-SOD活性在PC组中最低，在PB组中最高，PD、PE和PF组处于中间，但显著低于PA（分别–22%、28％和–11％）。单因素方差分析（P <0.001）显示，单独用T22处理（PB）即可显著地诱导产生CAT活性（与PA相比增加55％），而PF组有显著抑制（与PA相比–51％），PC、PD和PE与PA无显著差异（图4B）。图4 用或不用T22处理、接种或不接种CMV的1月龄番茄的SOD活性（A图）和CAT活性（B图）。柱形代表平均值的标准误差（n = 3）。不同小写字母表示通过单因素方差分析评估的处理之间存在显著差异（P≤0.05）。PA，健康对照；PB，仅用T22处理；PC，仅接种CMV；PD，先用T22处理，一周后接种CMV；PE，同时用T22处理和CMV接种；PF，先接种CMV，一周后用T22处理。单因素方差分析（P <0.001）表明，仅用T22处理（PB）或仅接种CMV（PC）后，叶片ABA含量显著增加（分别比PA高71％和60％），先接种CMV、一周后再用T22处理的PF也比PA高40％（图5A）。除了PD比PA高52％（单因素方差分析，P = 0.001）外，根中ABA含量也发现了相同的趋势（图5B）。单因素方差分析（P <0.001）表明，仅接种CMV的PC组，叶面JA/ET比率显著增加（比PA高2.5倍）（图6A）。关于组合处理，PD 和 PE组的JA/ET显著高于PA（分别高3倍和2倍）。单因素方差分析（P <0.001）表明，叶片总SA含量最低的是PA、PB、PC和PF。当T22处理在接种CMV之前（PD）或同时（PE）时，T22导致叶片总SA含量显著增加（分别比PA高约36倍和12倍）（图6B）。结合和游离SA含量的趋势与总SA的趋势平行。单因素方差分析（P <0.001）表明，仅接种CMV（PC）的根中JA/ET比率（图6C）显著降低（比PA低约2倍）。关于组合处理，PD和PE组的JA/ET比率比PA组下降很多（分别–56%和–37％）。单因素方差分析（P <0.001）显示，根中总SA含量的最低值出现在PF组（比PA少27％），而PD组最高（+122％）（图6D）。PB、PC和PE组的根中总SA含量较PA有增加（分别+21％、+ 77％和+ 73％）。通常，根中游离SA含量的趋势与总SA含量的趋势平行。在先接种CMV一周后再用T22处理的PF组植物中，根中结合SA浓度最低，但与PA和PC无显著差异。当在接种CMV之前（PD）或同时（PE）用T22处理，导致了根中结合SA的显著增加（PD和PE，比PA高约2倍）。 图5. （A，B）用或不用T22处理、接种或不接种CMV的3月龄番茄叶片（A图）和根（B图）中ABA含量。柱形代表平均值的标准误差（n = 3）。不同小写字母表示通过单因素方差分析评估的处理之间存在的显著差异（P≤0.05）。PA，健康对照；PB，仅用T22处理；PC，仅接种CMV；PD，先用T22处理，一周后接种CMV；PE，同时用T22处理和CMV接种；PF，先接种CMV，一周后用T22处理。图6. 用或不用T22处理、接种或不接种CMV的3月龄番茄叶片（A和B图）和根（C和D图）中JA/ET比率和总SA含量。柱形代表平均值的标准误差（n = 3）。不同小写字母表示通过单因素方差分析评估的处理之间存在的显著差异（P≤0.05）。PA，健康对照；PB，仅用T22处理；PC，仅接种CMV；PD，先用T22处理，一周后接种CMV；PE，同时用T22处理和CMV接种；PF，先接种CMV，一周后用T22处理。
5 讨论 木霉菌被认为是功能最广泛的生防制剂（BCA）之一（Mukherjee et al., 2013），长期以来被用于管理由病原真菌（Weindling, 1934; Wells, 1988; Vinale et al., 2009）和细菌（Segarra et al., 2009）引起的植物感染。最近，考虑到化学防治对病毒病无效，哈茨木霉T22菌株也被研究作为控制病毒的一种新方法（Vitti et al., 2015）。我们以前的一些研究是基于使用T22诱导番茄对CMV的防御反应，证明T22的作用涉及通过抑制RNA依赖性RNA聚合酶基因来调节病毒症状，以及ROS作为次级信使参与对病毒的防御响应（Vitti et al., 2015）。据作者所知，本研究提供了有关光合作用、抗氧化剂和植物激素在番茄-CMV-T22三方互作系统中发生变化的新信息。目前的结果证实，T22能够通过症状调节以降低病害严重程度和通过降低叶片中病毒效价两个方面来保护番茄免受CMV 侵害。对症状以及病害严重程度的观察表明，用T22处理可降低所有被测试植物中的CMV直至被抑制，这在3月龄番茄中效果更明显。ELISA分析数据显示，在接种CMV后再用T22处理时（PF），其效果特别明显。通过抑制症状的扩展，T22阻止了绿色光合组织的减少和叶绿素的降解，这在仅接种CMV的植物中（PC）和其他病理系统中都有观察到（Silveira et al., 2015）。施用T22的影响之一是促进了植物的生长，包括在逆境胁迫条件下（arman, 2000; Shoresh et al., 2010），间接原因是其强大的抗病活性，直接原因是通过（1）诱导植物激素的生物合成，（2）促进土壤养分的溶解和吸收，（3）促进根的硬化和发育，（4）提高碳水化合物代谢速率，（5）提高光合作用（Sofo et al., 2012; Stewart and Hill, 2014）。Windham等人（1986）首次描述了T22对番茄和烟草的促进生长作用。植物生长的促进还取决于植物的品种和基因型，在某些情况下，促进生长的不一致可能与生长条件的差异有关（Tucci et al., 2011; Stewart and Hill, 2014）。在我们的案例中，T22诱导的生长似乎让感染CMV的植物有所改善，因为T22的应用显著增加了株高。仅用T22处理（PB）的植物的地上干物质积累与PA、PD和PE之间没有显著差异。但是，仅接种CMV的植物（PC）或接种病毒在T22处理之前的植物（PF），地上干物质积累均显著减少。尽管与PB相比，T22在这种组合应用的处理组中对株高的影响并不显著，但其可能（1）与养分形成相互作用，（2）影响了植物生长必需养分的有效性（Benítez et al., 2004），从而（3）参与到从营养生长到防御激活的各种生理活动的重新分配（Gruner et al., 2013）。我们的数据显示T22改善了光合作用：无论植株年龄如何，在用T22处理并接种CMV的所有植物（PD、PE和PF）中，A值（光合活性）和总叶绿素含量均相同或更高。这一发现与木霉菌能够提高植物光合速率和效率（Vargas et al., 2009; Mastouri et al., 2010; Shoresh et al., 2010）的许多证据相一致，这种对光合作用的促进主要是通过改善植物的氧化还原状态来实现的（Harman, 2011）。在共生相互作用期间，真菌细胞中的酶活性影响根的库吸收活性，从而使碳分配趋向于根系，并提高叶片的光合作用（Vargas et al., 2009）。为了解释真菌共生对植物同化的改善作用，已有共生酶可以刺激光合作用速率的假设（Kaschuk et al., 2009）。在我们的案例中，感染CMV的植物（PC）的光合作用显著降低，这与其他作者的研究（van Kooten et al., 1990; Rahoutei et al., 2000）一致，如Alazem和Lin（2015）报道的那样，这是因为气孔导度降低了（正如在2月龄植物中所观察到的），气孔导度可以调节植物对入侵者的防御能力，尤其是在感染的早期阶段。因此，光合活性降低主要是由于气孔的限制所致，而3月龄PC组植物是由非气孔抑制所致（由不变的Ci值所证实），这也与其他病理系统已经报道的结果一致（e.g., Lorenzini et al., 1997; Zhou et al., 2004; Bermúdez-Cardona et al., 2015）。如Vitti等（2015年）报道，CMV感染导致ROS的产生，尤其是H2O2，它可以与蛋白质、脂类和脱氧核糖核酸反应，导致氧化损伤并削弱植物细胞的正常功能。为了克服这些影响，植物发展出既包含酶成分又包含非酶成分的抗氧化防御系统，这些系统（1）能防止ROS积累和（2）减轻感染期间发生的氧化损伤（Lehmann et al., 2015）。超氧化物歧化酶是防御机制中最重要的酶，它催化超氧化物歧化为O2和H2O2（Gill and Tuteja, 2010）。在我们的试验中，CMV单独使用（PC）或在PD和PE组中与T22组合使用，导致总SOD活性的显著降低，根据几项研究（Alscher et al., 2002; Battistoni, 2003; Broxton and Culotta, 2016）推测这可能是诱导了防御反应。相比之下，仅用T22处理的PB组植物的mit-SOD活性最高，这表明该酶在ROS解毒以防止氧化损伤和保护光合器官中起关键作用。CAT清除有毒和不稳定的ROS，并将其转化为毒性较低和更稳定的成分，如O2和水（Gill and Tuteja, 2010）。在单独用T22处理的植物中发现有CAT积累，这表明该酶可以增加细胞壁抗性，并作为诱导防御基因的信号。相比之下，在PC、PD和PE组观察到CAT活性没有任何增强，表明该酶可以与病毒（尤其是某些病毒要素，如CMV 2b蛋白，Inaba et al., 2011; Mathioudakis et al., 2013）相互作用，从而促进了H2O2在细胞中的持久性，进而可以诱导SA积累（León et al., 1995），这一点已分别通过PD和PE组游离和结合SA含量的显著提高得到证实。我们可以推测，CMV的2b蛋白（已知是病毒RNA沉默抑制剂，还参与病毒移动和症状诱导，Goto et al., 200）并未将CAT隔离在细胞中以有利于病毒感染，但它能结合过氧化氢酶基因（例如catalase3，Masuta et al., 2012）来诱导特定的防御机制。SA、JA和ET在植物病虫害抗性中有至关重要的作用。植物中的诱导抗性响应可分为两大类：系统获得性抗性（SAR）和诱导系统抗性（ISR）。SAR与局部和整体SA水平的升高相关，并且发病机理相关基因的表达通过SA途径介导。ISR并不依赖于SA或与病程相关的蛋白质的积累，而是取决于JA和ET调控的途径（Elsharkawy et al., 2013）。有证据表明，SA依赖的信号传导途径部分参与了ISR（Elsharkawy et al., 2012）。在我们的试验中，与健康对照PA组相比，当T22在接种CMV之前或同时使用时（PD和PE），随之触发了叶片JA/ET比率和SA水平的显著增加，这表明发生了ISR和SAR。如Vitti等人（2015）所揭示的，H2O2含量随之温和的上升，这证实这些化合物构成了一个自我扩增系统，其中JA和SA增强了H2O2的水平，而H2O2的水平可能与CAT的活性相互作用（如CAT活性水平不变所证实），这与Chen et al.（1993）的结论一致。在病毒感染之后用T22处理（PF）并未诱导SAR和ISR产生，但似乎刺激了ABA相关的抗性，这可以通过叶片和根部JA / ET比率和SA水平未发生任何改变以及ABA显著增加（相对于PA）来证实。根部JA/ET比率和SA水平表明T22处理可诱导PD和PE组植物中SAR的产生。这不足为奇，因为一项比较茎部和根部化学防御的广泛调查，证实茎部和根部具有不同的防御机制（Balmer and Mauch-Mani, 2013）。尽管在茎部也发现了根部的大多数化合物，如在我们的案例中，其组成水平可能存在极大差异。因此，关于植物激素在番茄-CMV-T22复合关系中的调节作用，可以得出结论，在所有用T22处理并接种CMV的植物中，（1）要求对ABA、JA、ET和SA产生响应，以降低病害水平；（2）不同激素相关信号途径之间发生了交互作用。叶片JA/ET比率以及在PD和PE组叶片和根部均观察到SA含量的显著增加，表明T22能够诱导对CMV的系统抗性，当T22在接种CMV之前或同时使用时，这种诱导不仅需要JA/ET，也需要SA信号途径。与Martínez-Medina等（2010）结论一致，这些发现表明，T22给予番茄抵御CMV的保护作用不是因为直接的拮抗作用，而是植物介导的现象。实际上，与PC相比，在PD和PE中所观察到JA/ET比率没有任何增大表明，由于ISR的自我激活，CMV感染是自限性的。本文中描述的数据表明，用T22进行早期处理能够通过植物激素的交互作用来诱导番茄对CMV-Fny病毒的系统防御反应。此外，T22能够改善光合性能并促进生长。总之，我们的数据表明，基于T22的策略是一个极为切实可行的实现有效防控CMV目标的方法。高效生防真菌-特锐菌® 
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