 具了解，血液保存始于第一次世界大战,当时是为了战争的需要。 战后发展较快,1947年 Mollison 研制成功 ACD(枸橡酸葡萄糖)保存液。1950年,Gibson 研制出GPD(枸橡酸盐-磷酸盐一葡萄糖）保存液,使在4℃保存血液的时间延长到21～28d。1960年,Nakon在此基础上添加腺嘌呤获得了36d的保存时间。在研究4℃保存血液的同时,人们在探索另外的方法保存血液。 红细胞的冰冻保存是1950年由 Smith 首先报道的,他们用甘油保护哺乳类动物的红细胞,进行了慢速冻存和融化处理。Lovelock 于1954年用一元醇、二元醇、多元醇、糖类和酰胺类作为红细胞的冷冻保护剂来保存红细胞。Bricka和 Bessis于 1955 年发现聚乙烯毗咯酮（PVP）与葡萄糖对红细胞有保护作用。Lovelock 和 Bishop 证明DMSO和甘油同样具有保护作用。Huggins 和偶田幸男分别在1963年和1968年报道了团聚冷冻红细胞的方法。 （1）红细胞的采集 红细胞的最佳保存环境是除去血浆、白细胞和血小板,得到浓缩红细胞,然|后再加人含有冷冻保护剂的营养液。1963年,Hoggins 提出了采用葡萄糖凝聚法,并与专用装置相结合,使红细胞的分离和冷冻保存取得了实质性的进展。其后又有人提出了连续离心法,该法被美国红十字会血液中心采纳,从而在全世界迅速普及。 （2）红细胞的冷冻保存 其降温方法一般有3种,即高浓度甘油慢冻法、低浓度甘油速冻法及玻璃化|低温保存法。 高浓度甘油慢冻法 甘油浓度为40%,甘油中含有乳酸钠、氯化钾、氯化钙、甘露醇或乳糖等,并使溶液 pH维持在6.8左右。在5～6min 内将细胞降温至一80℃以下,细胞解冻后存活率一般为80%～90%。 低浓度甘油速冻法 甘油浓度约为30%,甘油中再加人甘露醇、EDTA-国内有人将红细胞悬液移入装有小玻璃珠的冻存袋中,再将冻存保护剂缓慢滴入并轻轻震荡,使红细胞充分甘油化,室温静置10min后直接入一80℃冰箱保存（隋星卫等 1994)。解冻时直接将其放人37℃水浴,迅速融化,离心去除甘油,用盐水洗涤后可以直接用于临床。目前认为甘油是保存红细胞最好的保护剂,具有保护效果好、易洗涤的优点。由于甘油相对分子项里小,能日面应八通 2Na或氯化钠。在3～4min 内降到-196℃,解冻后细胞存活率为80%～96%。其羟基能和水分子形成氢键而与水分子牢固结合,使溶液在冰品存在时保持过状态,这样可以减轻对红细胞的损害。更有人曾深低温保存红细胞28年。 玻璃化低温保存法 1968年,Rapatz 和Luyet 用甘油作为低温保护冷却速率为10'℃/min,回收率近100%,电子显微镜观察到胞内外无冰晶形成1984年Boutron 和Arnaud使用0.5ml的红细胞样品冻存,分别用30%和35%爸|1,2·丙二醇作为低温保护剂,冷却速率为4000℃/min和500～1000℃/min,同收率为90%。 由于血液在医疗卫生领域起着极为重要的作用,是名副其实的"救命稻章》所以未来对它的研究会更深入、更广泛,涉及从理论到应用的各个方面。对于红细胞的低温保存,目前的发展趋势是冻干红细胞保存。冻干红细胞水化后能够重建生物学功能,回输后能够替代循环血液中的红细胞,满足临床需要。 在冻干保存红细胞的过程中必须注意以下3个关键因素。 干稳定剂冻 干稳定剂主要包括:大分子聚合物,如 PVP、葡聚糖、羟乙基淀粉、骨胶等;聚阴离子化合物,如焦磷酸、磷酸化肌醇等;碳水化合物,如葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖等;以及磷酸盐缓冲液及钾离子、钠离子等金属离子。研究表明,PVP的玻璃化转变温度受相对分子质量和浓度的限制,即其玻璃化转变温度随相对分子质量的增大而提高,随水分的丢失其在冻干体系 中浓度的增加而提高。冻干和保存红细胞应该在稳定剂的玻璃化转变温度下进行,这样可以减少细胞的损失。 再水化过程 在冻干过程中,红细胞处于高渗状态,保护液的渗透压约为3～5倍生理渗透压,所以在回输之前必须充分洗涤。红细胞在从高涂出太同到正常渗透压时,细胞膜容易皱缩、膨胀、破裂,故洗涤液的配制是提高细胞存活率的一个关键因素。 冻干过程的温度控制 红细胞的冻干首先要使细胞冰冻后由液态转变为固态，然后在冻干箱内抽气减压、升温,水分逐渐升华,继而使整个细胞悬液干燥。要想细胞成功冻干,冰冻、升温和减压这3个步骤的控制和协调就显得很重然当然这种存活率及回收率与常规冻存方法相比还有一定的差距,但其存在着用体积小、保存方便、便于运输的优点,特别适合于战场急教使用,是未采发展的一个重要方问。 （3）冷冻红细胞的复苏和洗涤 对于用高浓度甘油慢冻法冷冻保存的红细胞,解冻后应用梯度氯化钠溶液（12%、4%、1.6%、0.9%）洗涤,离心4次;也可用大量糖溶液（葡萄糖、果婚、蔗糖）以反复团聚法洗涤红细胞,洗涤后红细胞中的甘油浓度均降至1%以下,然后红细胞按1:1的比例混悬于0.9%氯化钠中,于1d 内使用。 对于用低浓度甘油速冻法冷冻保存的红细胞,其洗涤方法有两种: ① 离心法,用梯度甘露醇蔗糖浓度的生理盐水洗涤离心3次,再将红细胞混悬于 0.9%氯化钠溶液或氯化钠一葡萄糖-磷酸盐溶液中; ②团聚法,用大量葡萄糖甘露醇液反复3次团聚红细胞,然后将红细胞再混悬于上述溶液中。 |
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