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多肽类药物作为大分子药物和小分子药物之间的过渡态，也一直是制药领域关注的热点。 多肽/蛋白质都是由氨基酸这个基础单元通过肽键（酰胺键-CO-NH-）及其他键键合而成的。目前，对于多肽并没有一个十分严格的划分规定，通常认为20个以下氨基酸组成的为短肽，也有认为5/10个氨基酸以下组成的为短肽；由20~50/60个氨基酸组成的肽为中等肽。而我们一般认为的肽类药物为2~60个氨基酸组成，更大的结构或者是更大的分子量（>5000）则会被归入大分子/蛋白类药物中。 氨基酸作为组成多肽/蛋白质的初级单元，每个氨基酸均由一个羧基（-COOH），一个氨基（-NH2）和一条侧链组成。而不同氨基酸之间的差异在于侧链的不同。 天然氨基酸都是α氨基酸，对于氨基酸特有的结构来说，其包含一个酸性基团-COOH，和一个碱性基团-NH2。其pKa如下图所示：  除去上述氨基酸特有的基团外，对常见的氨基酸根据侧链的不同性质进行分类（酸性、碱性、中性；脂肪族、芳香族等），如下图所示： 1、酸性  对于酸性的氨基酸，上图中所标pKa为红圈圈出位置，用红色圈表示酸。 2、碱性
对于碱性的氨基酸，上图中所标pKa为蓝圈圈出位置，用蓝色圈表示碱。 3、芳香族  对于苯丙氨酸和色氨酸来说，除氨基酸本身代入的α氨基酸结构，侧链可能带进酸性基团或者碱性基团。如上图中三个芳香族类的氨基酸中，酪氨酸的侧链就带进一个酚羟基的弱酸。 4、脂肪族 
 5、亚胺（成环）  6、脂肪醇类  7、含硫氨基酸  含硫氨基酸具有还原性，其较易氧化。另一个需要关注的地方是，当多肽链中因存在半胱氨酸、蛋氨酸而存在二硫键二级结构时，需要特别关注稳定性过程中二硫键交换的产物。 8、酰胺类  末端的酰胺作为一个非常弱的酸/碱，在一般的分析条件下，可处理为中性，在分析过程中不用过多的考虑。当然这里的不用过多考虑仅仅指分析方法design的时候。在多肽药物的稳定性过程当中，如果肽链中存在此类氨基酸，需要特别关注水解的杂质。 我们了解了形成多肽/蛋白质的基础单元——氨基酸。多个不同或者相同的氨基酸通过酰胺键（肽键）结合，形成氨基酸序列，即一级结构，一级结构通常以无规则卷曲的方式存在，如下图所示：  在某些氨基酸序列中，某些氨基酸通过分子内相互作用，形成α-单螺旋或β-折叠结构，以使得该结构能量最低而使其结构最稳定。α-单螺旋是其一级结构中位于四个氨基酸间隙的残基相互作用形成氢键，从而稳定整个分子的结构；β-折叠结构是通过一级结构中相邻的线性段之间形成氢键来稳定结构。为使结构更稳定而形成的分子内折叠称为二级结构，如下图所示： 在某些氨基酸序列中，某些氨基酸通过分子内相互作用，形成α-单螺旋或β-折叠结构，以使得该结构能量最低而使其结构最稳定。α-单螺旋是其一级结构中位于四个氨基酸间隙的残基相互作用形成氢键，从而稳定整个分子的结构；β-折叠结构是通过一级结构中相邻的线性段之间形成氢键来稳定结构。为使结构更稳定而形成的分子内折叠称为二级结构，如下图所示：
在反相色谱分析过程中，蛋白质由于发生变性而失去二级、三级、四级结构的现象非常常见；但在离子交换或者体积排阻色谱中，却很少发生蛋白质变性。 多肽/蛋白质的结构就简单介绍到这，了解其结构能帮助我们更好的去进行分离分析。 从上一文中我们知道，作为基础单元的氨基酸除了具有相同的氨基和羧基结构，还具有不同的性质，包括酸性、碱性、芳香环带进来的大π键，巯基等带来的还原性。这些氨基酸带进来的不同性质决定了其组成的肽/蛋白质的性质。由于组成的肽链/蛋白质的氨基酸数量通常都较多，故一个肽可能同时具有多种不同的性质。 相较于小分子，肽类因组成的氨基酸数量较多，通常具有更大的分子量，更大的分子量带来更大的空间结构。 我们来看3个不同的肽类的空间结构： 1、依来多辛（Eledosin） 作为11个AA（氨基酸）组成的短肽类，其具有相对于一般小分子稍大的结构，如下图所示： 注：上图测试出的分子中最远距离原子间的距离为36.11Å。 2、鲑降钙素（Salmon calcitonin） 注：上图测试出的分子中最远距离原子间的距离为30~40Å。 3、Tesamorelin（替莫瑞林） 注：上图测试出的分子中最远距离原子间的距离为170Å以上。 （上述三个多肽的原子间距均是通过MOE能量最小优化后测得的原子间距） 从上述三个多肽可以看出，随着分子量的增加，其空间结构变得更大。对于仅11个氨基酸组成的依来多辛来说，其仅一个方向上原子间距较大（36Å），而对于鲑降钙素来说，其多个方向上的原子间距达到30Å以上，对于更大体积的替莫瑞林来说，其最大原子间距已达到了170Å以上。当然，上述几个多肽仅作为例子，便于大家的理解，实际上，在溶液中的分子可能具有更小的能量及更小的空间结构。 分子空间结构的大小决定了分析过程当中色谱柱孔径的筛选。 对于反相色谱来说，通常具有从60~300Å孔径的填料。我们知道，保留行为的发生都发生在多孔填料的表面上，而对于多孔材料来说，绝大多数（>95%）的表面积都分布在小孔内部，也即绝大多数的保留分离行为都发生在多孔材料的孔内。要形成有效的保留，首要的一点就是待分离组分能顺利的进入孔内。 然而，待分离分子在孔内的摩擦系数较大，会降低进入孔内的样品分子的扩散，使得柱效降低，所以一般要求孔径要大于样品分子直径的4倍以上，才能保证样品分子能自由出入孔内，而维持正常的谱峰展宽。 参与文献 |
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