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作者：米粒儿 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 今天米粒儿和大家分享一篇9月2日刚刚发表在Hepatology上和免疫微环境相关的研究论文。 题目：Hepatic Hippo signaling inhibits protumoural microenvironment to suppress hepatocellular carcinoma（回复170907可下载，一周有效） Hippo信号通路是主要抑癌途径，其在抑制肝细胞增殖，存活和肝细胞癌（HCC）形成中起关键作用。Hippo激酶（Mst1和Mst2）通过抑制Yap / Taz转录活性抑制HCC增殖。由于人体HCC发生主要是由慢性肝脏炎症驱动的，那么Hippo信号是否通过调节免疫微环境来抑制HCC呢？ 本研究以此为重点，研究发现肝细胞中的Hippo信号通过调节Yap依赖性Mcp1表达，抑制巨噬细胞在抗肿瘤微环境形成过程中的巨噬细胞浸润，维持正常的肝脏生长，本研究为治疗肝癌提供新的靶点和策略。 作者是如何得到这些结论的呢？仔细批讲一下吧。 结果一：Mst1 / 2 DKO肝中的Mcp1表达增加 RNA-seq分析显示，在肝脏中具有检测表达的所有趋化因子基因中，Mcp1的上调最为明显（图1A）。 DKO肝脏中的Mcp1蛋白水平也升高（图1B）。在DKO肝脏中，Ccl4也被称为巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1β），其编码针对各种免疫细胞（包括单核细胞）的化学引诱剂24表达较不强烈且较少上调（图1A）。 随着肝脏过度生长变得更加严重，在4月龄的DKO肝中发现许多肿瘤结节，11 12 15 Mcp1的表达也更加高度上调（图1C）。DKO小鼠的循环血液中的Mcp1蛋白水平与对照相比显著增加（图1D）。 为了进一步研究Mcp1是否从肝细胞分泌，作者分离了Mst1 - / - ; Mst2f / f肝细胞，并用Cre Adeno-病毒（Ad-Cre）或Ad-GFP作为对照感染，发现Ad-Cre感染的肝细胞中培养基中的Mcp1蛋白显著增加（图1E）。这些结果表明，肝细胞中Hippo信号传导的损失促进了Mcp1的表达，这可能导致巨噬细胞浸润增多。 Fig 1 在Hippo突变的小鼠肝脏内MCP1（Ccl2）表达升高 结果二：巨噬细胞是DKO肝中生长和肿瘤形成所必需的 下一步作者继续讨论巨噬细胞浸润是否通过消耗巨噬细胞来促进DKO肝中的肝细胞生长和HCC的形成（图2A）。酸二钠脂质体治疗导致肝脏巨噬细胞数量的显著减少，脾脏大小，肝/体重比和肿瘤数量（图2B-F）。 此外，IL-1β和IL-6的表达降低，表明巨噬细胞消耗减少后肝脏炎症减轻（图2G）。这些结果表明，DKO肝中的巨噬细胞促进肝脏炎症，生长和肿瘤形成。 Fig 2 巨噬细胞缺失降低DKO肝脏和肿瘤生长 接下来作者检测了Mcp1是否通过中和抗体阻断巨噬细胞功能从而增加DKO肝中巨噬细胞浸润。作者建立了 AlbCre; MST1- / - ; Mst2f/F; McP1f/f（TKO）小鼠模型，发现巨噬细胞，特别是CD11bhiF4/80lo浸润的单细胞/巨噬细胞在TKO肝脏中显著降低（图3A，B）。与DKO小鼠相比，TKO小鼠的肝脏过度生长和肿瘤形成明显减少（图3C-E）。这些结果表明DKO肝细胞中的Mcp1表达通过调节巨噬细胞浸润促进肝脏生长和肿瘤形成。 Fig 3 MST1/2 DKO小鼠中Mcp1表达降低可减轻肝脏表型 结果三：DKO肝中的巨噬细胞表现出M1和M2特征 巨噬细胞在激活期间可以表现出一系列极化表型，从促炎M1表型到替代/M2表型。本文检测DKO肝中单核细胞/巨噬细胞是否有不同种群。已经表明Ly6Chi标记具有M1个特征的炎症和组织损伤性单核细胞，而Ly6Clo细胞表现出具有M2巨噬细胞特征的抗炎和组织保护性表型，但它们衍生自Ly6Chi细胞。 发现CD11bhiF4 / 80lo IMs（图3B），CD11bhiLy6Clo和CD11bhiLy6Chi单核细胞在DKO肝中增加，两者在TKO肝脏中都显著降低（图4A）。 为了进一步测试在DKO和TKO肝脏激活期间的巨噬细胞极化中作用，作者检查了与M1或M2极化相关的标记物的表达。发现在DKO肝脏中与M1样（CD86和IL-1RA）和M2样（Mrc1和Ym1）巨噬细胞相关的基因表达均上调，但在TKO肝中这种上调减少（图4B）。 在DKO肝脏的肝细胞部分未检测到M1或M2标志物表达（数据未显示）。此外，M1标记iNOS和M2标记CD20626 31的免疫组织化学（IHC）也显示DKO肝中的M1和M2巨噬细胞极化（图4C，D）。 在TKO肝脏中，伴随着巨噬细胞总数的减少（图3A，B），iNOS和CD206标记的巨噬细胞都减少。这些结果表明M1和M2极化是由Hippo缺陷型肝细胞通过Mcp1诱导的。 Fig 4 活化的巨噬细胞呈现M1和M2特性 结果四：巨噬细胞调节肝细胞增殖和生存不依赖于Hippo信号通路 接下来作者检测了巨噬细胞如何分布在肝脏中，以及这些巨噬细胞在肿瘤发生前后表型是否改变。作者采用CD11b和Ly6C IHC识别IM和F4 / 80 IHC来标记巨噬细胞群体（图5）。发现DKO肝脏中的肿瘤大部分由CD11bhi Ly6Clo F4 / 80lo IM组成，其不同于非肿瘤区域组织中的Kupffer细胞和IM。 Fig 5 在肝脏中间的不同巨噬细胞亚群 由于巨噬细胞在调节肝细胞增殖和存活起重要作用。作者接下来主要回答MCP1缺失导致的巨噬细胞减少是否细胞因子和炎症因子的信号转导（图6）。在DKO肝中，JNK，Erk，Stat3和Smad2的激活增加（图6A-C）。 在TKO肝脏中，与DKO肝脏相比，pStat3，pSmad2和pJNK水平降低，IκB和NF-κB水平和pErk水平没有改变（图6A-C和在线补充图S7）。这些结果表明，升高的JNK和Tgfβ信号传导可能是由于Mcp1介导的巨噬细胞浸润和活化引起的，这可能导致肝脏过度生长和HCC形成。 下一步，为了测试Hippo信号本身也可以被巨噬细胞或由Mcp1形成的微环境调节，作者检测了Yap和Taz的蛋白质水平，TKO肝脏中Yap蛋白水平没有变化，Taz水平相当下降（图6D）。然而， Taz的减少不足以引起已知由Hippo信号传导调节的细胞和分子变化。 包括Jagged 1（Jag1）在内的Yap/Taz靶基因的表达没有被Mcp1缺失改变（图6E，F）。此外，Mcp1缺失无法挽救由Hippo信号缺陷引起的卵圆细胞扩张（图6G）。 有趣的是，尽管在TKO和DKO小鼠的肝脏中具有类似的Yap / Taz活性，已被证明在Yap / Taz下游作用的细胞周期蛋白（CcnE），cMyc和存活蛋白的表达在调节细胞增殖和存活中被降低肝脏与DKO肝相比（图6H），表明这些基因也可能被Mcp1介导的肝微环境间接调节。 Fig 6 Hippo信号通路通过影响Mcp-1调节的肝脏微环境重塑以非直接作用方式调节细胞增殖 结果5：Mcp1表达由Yap / Taz直接调节 接下来，作者主要探讨Mcp1表达是如何调节的。作者假设Mcp1由Yap转录因子直接调节。首先在体内验证Yap表达下降是否能够降低Mcp1的高表达和巨噬细胞浸润。在Mst1 / 2 / Yap缺陷型肝脏中，Yap的减少几乎完全恢复肝脏正常生长。 作者还发现Yap，Mcp1和F4 / 80蛋白以及Mcp1和F4 / 80信使RNA（mRNA）水平都显著性降低（图7A，B）。这些结果表明，Hippo激酶通过调节Yap的活性抑制Mcp1表达。 接着，作者进一步在体外验证Mcp1是否是Yap的直接转录靶标。 Yap通过与直接与DNA共有序列基序结合的转录因子TEAD激活转录（图7C）。在Mcp-1转录起始位点上游约400bp的哺乳动物中存在一个保守的TEAD结合基序（图7D）。 有趣的是，基于ChIP-seq数据，TEAD结合位点位于与转录活性基因相关的H3K4me3和H3K27ac组蛋白修饰丰富的区域（蓝盒）中（图7E）。 为了测试YAP是否确实与该区域结合，作者对人类肝细胞细胞系Huh7细胞中MCP1启动子区域中指定的TEAD结合位点进行了ChIP-qPCR分析（图7F），正是MCP1是YAP转录因子的直接靶标。 Fig 7 Mcp-1是Yaz/Taz的直接作用靶基因 接下来，作者检测了HCC患者MCP1表达与YAP活性之间是否存在相关性。分析了TCGA数据库中人肝癌样本的mRNA测序数据，发现MCP1 mRNA水平与人肝癌中众所周知的YAP靶基因CYR61和CTGF相关（图8A）。 此外还分析了存在于基因表达综合征（GSE14520）中的另一人类HCC队列数据，进一步加强了这一结论。值得注意的是，Yap特征的表达与MCP1表达也很好相关（图8B）。 此外，IHC分析显示，在19个人类HCC样品中的8个中，YAP和CYR61以及MCP1蛋白表达均增加，但在相邻的非肿瘤组织或正常肝脏对照样品中不显著（图8C和在线补充表S1）。由于不同数据集中的HCC可能是由各种分子变化引起的，所以在HCC患者中MCP1产生的YAP激活可能是HCCs大量肿瘤发生增殖的常见机制。 Fig 8 在HCC病人体内Mcp-1表达与Yap相关 参考文献：Hepatic Hippo signaling inhibits protumoural microenvironment to suppress hepatocellular carcinoma
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