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临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立 卫生部临床检验中心李金明 核酸(DNA和RNA)是生命现象的基础。小到病毒、细菌等微生物，大到动植物和人类，都无一例外。因为主导生命活动的受体、细胞因子、酶、激素等均不过是核酸发挥功能作用的表型，均由核酸决定，在核苷酸序列上哪怕是单个碱基的变异，都会引起表型的完全改变，并进而影响生命功能的发挥，导致疾病的发生。因此，在核酸或称为基因水平上检测，对临床疾病本质的揭示就要更深一步。也正因为核酸是生物体生命活动之源，对于感染性病原体的检测，从核酸着手，最能反映病原体在机体内的出现和消长。 自从美国Cetus公司Mullis博士在1983年发明聚合酶链反应(PCR)这种核酸扩增技术以来，由于其极高的检测灵敏度和特异性，因而在临床感染性疾病、遗传病、肿瘤等的诊断和疗效观察上得到了广泛的应用，在器官移植的基因配型上也是难以替代的技术。其应用大大提高了上述疾病诊断的准确性和快速性。但临床PCR检验必须按规范要求进行，并有严格的实验室质量管理，否则，因其极高的检测灵敏度，实验室稍有以前扩增产物的污染，或在标本核酸提取过程中标本间的交叉污染，均可导致假阳性结果的出现。同时，也会因为试剂和实验消耗品的质量不过关、仪器设备的维护校准不到位，或操作的不规范等，也很容易出现假阴性结果。 第一节临床PCR实验室的分区规划设计 如何规划设计一个合格的实验室是每一个临床PCR实验室首先要遇到的问题，因为一个实验室一旦经过设计并完成装修，如不符合要求，则会出现很大的麻烦，甚至不得不拆了重来。那么怎样才能设计一个合格的实验室呢?简单地说，就是十六个字，“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作”。同时要注意临床标本的接收问题。 对于临床PCR实验室的分区及其设备配置，卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号)中作了明确规定，并且卫生临床检验中心发出的配套文件《临床基因扩增检验实验室工作规范》(卫检字[2002]8号)又对各区的功能及注意事项作了阐述。但具体到某一个实验室，如何根据其实际情况和环境设计一个符合要求、可保证检测质量及方便工作的PCR实验室，实验室技术人员仍时常感到心里没底，因此，本章拟对临床PCR实验室分区规划设计和工作流程的一般原则再作一些具体的阐述，并尽可能举出一些实例加以说明。 一、临床标本的接收 对于诸如血清(浆)、分泌物、痰液、尿液、脑脊液等临床标本的接收、分离血清、编号乃至保存，一个临床PCR实验室究竟应在何处进行较为合适?这是一个非常实际的问题，也是作为一个临床实验室首先要解决的问题，经常有同道提出来。 要回答这个问题，首先让我们来看一下临床标本送到实验室以后我们所要做的是什么?一般来说，当临床标本如血液、分泌物和其他体液等送到实验室后，按照临床基因扩增检验质量保证对标本采集、运送和保存的要求，对标本接收编号后，即应尽快对其分离血清(浆)或预处理后保存待测，并且根据对临床标本较长期保存的要求，最好是在分离血清(浆)时，分出两管来，一管用于测定，一管长期保存备查。因此，最好是在PCR实验室的四个独立测定区域之外的地方接收临床标本，有一台分离血清(浆)用离心机、一台生物安全柜、一台冰箱、加样器及相应一次性经高压处理的消耗品如带滤芯吸头、标本接收编号记录本以及记号笔等即可。如果不在标本接收区分离血清(浆)标本，只是简单的接收，则就不需要分离血清(浆)用离心机、生物安全柜、加样器及其消耗品。 通常，有许多实验室将临床标本的接收处放在标本制备区，而一个医院临床标本的运送至实验室往往不会在同一个时间，标本来了就应该进行接收登记、交接签字和对标本进行编号，并尽快分离血清(浆)或相应处理，因此，如将标本接收处放在标本制备区，就会因为临床标本的接收而使实验室工作人员频繁出入标本制备区，从而增加实验室污染的机会。而且由于条件所限，有相当一部分临床基因扩增检验实验室的设置为一个区套一个区的模式，要进入标本制备区就必须先进入试剂准备区，最后还只能经扩增区从产物分析区出实验室。这种情况下就必须将临床标本的接收处放在四个区之外的地方，可以与其它临床标本的接收、编号和保存处放在一起。如在标本接收处对血液标本进行血清(浆)分离，则要注意防污染，所用器具符合要求并在生物安全柜中进行。 所接收的用于PCR检验的标本应收集在原始密闭的一次性无菌容器中，不能接收从其它检测如生化、免疫检验等分出来的标本，因其有较大的发生标本间污染的可能性。接收临床标本时，操作者应穿工作服及带手套，每份标本应放在适当的架子中，防止泄漏，并给出一个唯一性编号。标本的保存按要求进行，冰冻通常在-20℃~-70℃条件下，避免反复冻融。在核酸提取时，由PCR实验室人员将标本带入至标本制备区。 二、临床PCR实验室分区设计的一般原则及工作流程 (一)临床PCR实验室的分区设计的一般原则 前面说到，要设计一个合格的PCR实验室，简单地说，就是要做到十六个字，“各区 独立、注意风向、因地制宜、方便工作”。 各区独立，其含义就是PCR实验室的四个区(如使用实时荧光PCR则只需三个区，因其扩增和产物分析同时完成，不需要产物分析区)即试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物分析区，应该是在物理上完全分开的各自独立的区域，并且不能有通过连通各区的中央空调、分区装修隔断不密封、传递窗不密封等发生空气直通的现象。有的实验室在分区设计时，只是考虑实验室在形式上的分区，如实验室各区的分隔不完全，有相通之处;或一个区套一个区的实验室各区间无缓冲间(如图3-1A和B),或此类实验室有缓冲间却在装修时，采用家庭装修模式，即上吊推拉门或平开门，门的下面留有门缝;或实验室中央空调相通;或试剂物品传递窗闭封不严等。   图3-1 不合要求的一个区套一个区的实验室分区模式 在此想着重强调一点的是有关传递窗的设置。传递窗的设置是的一把“双刃剑”,一方面其方便了试剂物品在不同实验区间的传递，但另一方面也增加了交叉污染的危险。因此，一个合格的传递窗应是双开门密封严实的，并且两边的门最好是连锁装置，即当传递窗一侧的门没有关好时，另一侧门不能打开。此外，传递窗内应有紫外照射装置，并在使用后即进行照射。 中央空调如造成了实验室各区间的互通，则其不能使用，需在各区内另行安装分体式空调。 第二是注意风向。由于PCR对原始靶核酸有一个指数扩增过程，因此，每次检测后，均有大量由阳性标本扩增而来的“产物”存在，这种扩增产物如为开放式存在，以及在检测中的吸取，就会因为“产物气溶胶”的形成及扩散，而极易对以后新的扩增反应产生“污染”，为防止这种污染的发生，就需要在对基因扩增检验实验室进行严格分区的同时，还要注意实验室内空气在不同区的流向。关于这一点实验室通常会有什么样的误解呢?曾有同道说，准备将自己的PCR实验室装修成超净的实验室。这是没有必要的，因为基因扩增检验中的产物只是病原体如细菌或病毒核酸中一极小部分，通常也就一二百个核苷酸，实时荧光PCR的扩增产物更小，有的只有几十个核苷酸，这么小的分子可以说几乎是无孔不入，通常的超净装修设计对其来说是没有用的。因此，最关键是要注意空气流向，防止扩增产物顺空气气流进入上游扩增前的“洁净”区域。PCR实验室的空气流向，通常可以通过实验室的相对正压(通常可通过安装新风进气系统)或负压(可通过排风装置)来达到目的，如图3-2A和B及图3-3、3-4所示。因为在实验室安装正压或负压系统通常比较困难，所以也可以按照从试剂准备区→标本制备区→扩增(及产物分析)区方向空气压力递减的方式进行(如图3-2C)，最简单的做法就是在试剂准备区不装负压排风装置，在标本制备区安装负压排风装置或一个排风扇，在扩增(及产物分析)区安装功率强于标本制备区的负压排风装置或两个排风扇。 第三是因地制宜。PCR实验室不可能是千遍一律的，必须要具体情况具体分析。实验室各区既可是相互邻近，也可以分散在同楼层的不同处，甚至不同的楼层。新建实验室可以做得尽可能合理和规范，并且易于实验室的管理。旧的实验室则只要符合标准即可，不必强求理想状态。图3-2A和B的实验室都是属于满足基本要求的模式。     (C ) 图3-2 因地制宜的实验室设置模式 最后是方便工作。规范地设计PCR实验室的目的是为了在物理上防止”污染”的发生,但在实验室各区设计及布局时，应最大程度的考虑在日常检测工作中，工作起来是否方便，像设计如图3-1的实验室，如在各区间设一个缓冲间，虽然符合了各区独立的概念(各区间处于永久的物理隔状态)，但并不便于日常工作，主要有以下几点:(1)标本制备区和扩增区等中间区域进入不便和无法重复进入，要进入此类中间区域，就必须经各区域一圈;(2)不便于工作服和工作鞋的换穿，试想当工作人员要进入一个区域时，属于正在工作区域的工作服和工作鞋如何脱换，于是不得不准备多套工作服和工作鞋。(3)不利于实验室的管理。因为工作上的极度不便，按规范管理实验室在实际上就很难做到，这样无形中增加实验室“污染”的机会。 (二)较为理想的PCR实验室的分区设计 那么, 什么样的PCR实验室是最标准的?这通常很难界定，图3-3和图3-4所给出的实验室设置图应是一个较为理想的设计模式。其有一个专用走廊，试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物分析区很规范地排列在一起，前三个区各有一个缓冲间，工作人员可在此区间内更换工作服和工作鞋，顶上可装一紫外灯。但缓冲间的最主要的作用，不是为了工作人员更换工作服和工作鞋，而是为维持空气流向，即通常在缓冲间顶上安设一排风或进风装置，如为排风装置，可通过通风管道通向大气外，当排风装置处于运行中时，缓冲间内即为负压状态(图3-3)，一旦有实验区外的风进入，其在缓冲间内即被抽走，从而实验室外的空气不会大量进入到实验区域内。如为进风装置，则有通风管道进行送风，运行时，缓冲间可为正压状态(图3-4)，使这三个区的空气流向为由实验区域内向实验室外，以防止产物分析区内 扩增产物随空气流动的进入。缓冲间内通向内实验室和走廊的门可安装一种磁性连锁装置，当一个门打开时，另一门必须处于关闭状态，否则即打不开，不会出现两个门同时打开的情况。产物分析区可不设缓冲间(也可设)，可设为负压状态，可通过在房间内安装排风装置来做到这一点，比较好的做法是设置一个抽风橱，可将电泳系统或其他扩增产物检测系统置放于抽风橱内。最为简单的就是在对外的窗户上装一个排风扇即可，使空气流向由实验室外向实验室内，以防止扩增产物的随空气流出。产物分析区也可设在远离上述三个区域的地方。对于PCR实验室各区的空气流向，如不能做到上述理想状态，也可通过不同区内安装不同功率或数量的排风扇来满足基本要求，即尽可能使实验室内空气在PCR实验室专用走廊内，按试剂准备区门口→标本制备区门口→扩增区门口→产物分析区门口的方向流动，避免空气的反向流动，将PCR后区的扩增产物带向PCR前区的洁净区域。 PCR实验室的每一区域都须有明确的标记，工作按试剂准备区、标本制备区、扩增区至产物分析区单一流向进行，各区的仪器设备包括工作服、鞋、实验记录本和笔等都必须专用，不得混淆。此外，上述四个工作区域内还应有固定于房顶的紫外灯，以便于工作后区域内的空气照射。  图3-3.缓冲间为负压排风的理想PCR实验室设置模式  图3-4.缓冲间为正压进风的理想PCR实验室设置模式 PCR实验室的标本制备区要求配备生物安全柜，生物安全柜应为外排式，须有外接管道排风，可采用30%或70%外排的二级生物安全柜。外排式生物安全柜有助于防止提取核酸时产生的含靶核酸的气溶胶在实验室内蓄集存留。标本制备区内有生物安全柜，在建设实验室时，一定要充分考虑实验室内进风的量和速度，并且所要安装的分体空调和进风口要避免干扰生物安全柜的使用。 从防止实验室间交叉污染看，图3-4的模式要优于图3-3，但正压进风对于实验室的建设要求可能要更高一些，因而较难做到。 上述理想情况下的临床PCR实验室的分区设计，绝大部分临床实验室很难做到，在实际上也不一定非得要达到这种理想状态。有的临床实验室在PCR实验室的装修上追求豪华和高档次，其实并无必要，因为PCR实验室进行规范化分区，其根本目的是为防止实验室交叉污染提供一个物理上阻隔基础，但要达到防止交叉污染的目的，光有实验室的规范分区并不充分，实验室日常工作的严格管理和工作人员对规程的遵守，更是核心之所在。 综上所述，一个符合基本要求的临床PCR实验室，在实验室分区上至少要满足以下几个方面的要求:(1)试剂准备区、标本制备区和扩增及产物分析区等三个或四个区域在物理空间上，必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。(2)各区的可移动的仪器设备及各种物品包括实验记录本、记号笔、试管架及清洁用具等必须专用。(3)应在标本制备区、扩增及产物分析区等相对有可能出现“污染物”的区域安装排风扇或其它排风和有效的装置，以使空气按试剂准备区→标本制备区→扩增(及产物分析)区方向流动。 (三)临床PCR实验室各区的主要功能及工作流程 1.试剂准备区关于试剂准备区也有同道提出这样的问题，即使用所有试剂都已准备好备用的商品试剂盒时，还需要试剂准备区吗?回答是，当然不需要。但需注意的是，并非所有的商品试剂盒都是如此，有些尚需要实验室配备一些简单的试剂，如75%乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水等。再有就是临床PCR实验室在某些情况下，也会从事或帮助其它科室从事一些与基因扩增有关的研究工作，或者是随着实验室技术人员的能力的发展，可能以后会有越来越多的实验室，在从事临床分子诊断时将更多的使用实验室自制(home-bred)试剂，因而试剂准备区有必要设置，只不过是在空间上可以经济合理的考虑。 试剂准备区的仪器设备主要有加样器、天平和离心机等，最好配备超净工作台。加样器、天平和离心机等除了要专用外，还应有定期校准。制备扩增反应混合溶液用的化学试剂 应使用分子生物学级的，试剂配制好以后应有质检，质检包括两个方面，一是看是否有污染，即是否有假阳性存在;二是使用弱阳性质控物检测试剂的扩增检测效果。总而言之，实验室应建立一套适合于自身的试剂质检标准操作程序(SOP)。此外，试剂准备区是PCR实验室中最为“洁净”的区域，不应有任何核酸的存在，包括试剂中所带的标准品和阳性对照，这些试剂及核酸提取试剂均应直接放在标本制备区。在自己配制试剂时，最好是一次较大量配制，然后分装成小瓶保存，每次检测时，取出一小瓶使用，未用完的即弃掉，不再使用，因为试剂在使用过程中，即有可能发生“污染”，下次再使用，就有可能造成试剂原因的假阳性结果。 2.标本制备区对于临床基因扩增检验来说，标本制备区往往是首先进入的工作区域。该区域应限定只有本区的工作人员才能进入，同样仪器设备、工作服及各种物品都必须专用。进行核酸提取时，将标本从指定的标本接收及保存处拿至标本制备区，并进行有关记录。标本的制备应在生物安全柜内进行，可防止标本气溶胶的扩散。生物安全柜不应放在实验室门口等易受人员走动影响的地方，也不应直对分离式空调。在标本制备的全过程中都应戴一次性手套，并经常更换，主要是因为在实验操作过程中，手套的污染很容易导致标本间的交叉污染。当处理可能具有传染危险性的标本时，最好是戴两副手套，当手套与标本有接触时即可弃掉外层手套。实验时所使用的加样器吸头必须带滤芯，并且要注意的是，滤芯不能是后插入的，而应是结合在吸头内壁上的巯水性膜滤芯，这样才能有效和可靠地防止气溶胶对加样器的污染。 在标本制备过程中，通常会有温育步骤。温育既可在加热模块也可在水浴中进行。当使用加热模块时，如在模块孔中填入二氧化硅细砂，然后将标本管置于细砂中温育，可得到较为一致的温育温度。而当使用水浴时，则应使用可漂浮在水面上的试管架如有孔海绵等。加热模块应定期进行孔间温度差异的检验并校准，水浴应在每次使用时，都要对所设置的温度使用已经过校准的温度计进行校准。经高温温育后的标本，应冷至室温后再离心，使得由于加热回流的标本液体能离心至离心管底部。 标本制备区内的生物安全柜、超净台、加样器、离心机及其它设备都应定期或在有明显已知污染后，使用中性消毒剂如异丙醇、戊二醇等或10%次氯酸钠溶液消毒，使用10%次氯酸钠溶液消毒后，应再用70%乙醇洗涤去除残留的次氯酸钠，因为其对金属表面有氧化作用。在PCR实验室各区中，标本制备区是唯一直接与临床标本接触的区域，因此要注意生物安全问题，应有洗眼器，并配备一个急救箱，箱内可放置75%酒精、络合碘、棉签、创可贴等必要的急用药具。 3.扩增区扩增反应体系的配制和提取核酸的加入，可在标本制备区也可在本区内进行，关键是要防止产物的污染。如果空间允许的话，也可在一个独立的区域内进行。整个过程可在一密闭的带有紫外灯的防污染罩内操作，核酸模板样本加入时应使用带滤芯吸头，在打开及盖装有核酸模板样本的离心管盖时，要注意防止样本对手套指尖的污染。加样时，先加提取的核酸模板样本，每加完一个即盖好盖子，然后加阳性质控核酸模板，再就是标本制备阴性质控和仅含按样本一样稀释的主反应混合液的扩增阴性质控，这样做的目的是，最大可能地测出以前扩增产物的交叉污染。采用“巢式”PCR方法的第二轮扩增的加样，必须在本区进行。 扩增区的主要仪器就是核酸扩增热循环仪。热循环仪的电源应专用，并配备一个不间断电源(UPS)或稳压电源，以防止由于电压的波动对扩增测定的影响。此外，还应定期对热循环仪孔内的温度进行校准。每次扩增后，可使用可移动紫外灯对扩增热循环仪进行照射。对扩增孔内的消毒清洁，可首先用浸泡10%次氯酸钠的棉签逐孔消毒，再用浸泡70%乙醇的棉签清洁。次氯酸钠的使用有助于污染的扩增产物的降解。 4.产物分析区产物分析区是临床基因扩增检验的最后一个工作区域，也是需要打开扩增后反应管进行扩增产物分析检测的地方。由于本工作区应设置为负压状态，空气流向为由外向内，以防止扩增产物气溶胶流出，故本区可无缓冲间。 扩增产物的分析方法在目前国内已有国家食品药品监督管理局(SFDA)批准文号的试剂盒中现有两种方式，一是使用聚苯乙烯微孔板条作为杂交固相的微孔板上杂交;二是使用硝酸纤维素膜作为杂交固相的膜上杂交。使用微孔板上杂交模式，测定中严禁将孔内反应液或洗液倒入实验室水池内，而必须采取手工吸加或用洗板机洗板。如使用膜上杂交，同样不能将反应后的液体倒入池内，而应集中倒至1mol/L HCl溶液中，浸泡半小时以上后至远离基因扩增检验实验室处弃掉。如实验室自制试剂，可能还要用到产物酶切和电泳的方法，对于电泳液的处理也一样，不能随意倒入实验室水池内，处理同上。 本区所使用的仪器设备可能有电泳仪、酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等，酶标仪应定期校准，洗板机每次使用完都应进行清洗，其它如加样器和水浴箱可按有关方法进行校准。 第二节临床PCR实验室质量管理体系的建立 《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号)是卫生部针对一项检验技术的临床应用管理下发的第一个法规性文件，要求临床PCR实验室，不但在实验室分区设计及仪器设备等硬件上要满足开展临床检验的条件，而且要求实验室在日常工作要有文 件化的工作程序。对于临床实验室来说，这是从来没有过的。我们的检验科多少年来遵循的都是一种固定的“经验管理”模式，对日常检验工作，通常缺乏一个文件化的程序，只是购买到商品试剂盒以后，按照试剂盒的说明书去进行检验，对试剂盒本身也缺乏相应的质检，日常检验基本上是完成即可，至于完成的质量怎么样，心中无数，只能从临床大夫和患者投诉的多少来做判断。做得好一点的检验科，还多少有一点室内质控，或是参加了室间质评，做得差的，很多检验项目根本就没有室内质控。但近年来，随着临床实验室质量保证的概念逐步地进入我们的临床检验实践，我国临床检验正进入到一个规范化和标准化的时代，尤其是临床PCR实验室，起到了一个很好的领头和示范作用。在全国，一大批从事临床PCR检验的专家和同道，在他们的日常工作和申请实验室验收过程中，总结经验，建立了不但在形式而且在实质上符合当今实验室质量管理模式的临床PCR实验室。本处的许多叙述，有本人的一些体会和理解，但很多的概念应该说是来自于我们全国各实验室的同行们实际工作经验的启发。 一、实验室质量管理概述 实验室质量管理是说起来容易，做起来难。要说吧，其基本内容也就四句话，就是写你所应做的，做你所写的，记录你已做的和分析你已做的。所谓写你所应做的，就是将在实验室检测中要做的事按照所依据的管理标准以文件化的形式表述出来，形成一个实验室的质量管理文件，通常包括质量手册、质量体系程序文件和标准操作程序(SOP)等。质量手册的基本定义是:阐明一个实验室的质量方针，并描述其质量体系的文件。其主要内容包括目录、批准页、前言、质量方针、组织结构、人员职责、实验室设施环境、仪器设备、溯源性、检验方法、标本管理、记录、报告等，是对上述各方面质量管理的一般性描述。程序文件则是对通用于整个实验室的某些方面工作的文件化描述，主要包括实验室文件和档案等的管理、内审、管理评审、合同评审、预防措施、纠正措施、人员培训、投诉处理、保密、计算机安全、新项目开展、量值溯源、试剂仪器及实验用品的购买、标本管理、废物处理等方面。而SOP最为具体，最具有可操作性，也是使用频率最高的文件，与实验室的日常工作密切相关，如某个具体项目临床标本的收集、处理、保存、检测等，具体仪器的操作使用、校准及维护等。SOP与程序文件之间的区别在于后者的原则性要强一些，针对的是一个系列或一个方面的工作，但在有些方面如可操作性上也没有根本的区别，一个原则是如果程序文件已明确叙述并很清晰的，则不必再起草重复性的SOP，如果特定程序文件尚包括不了的，则可再在其涵括范围内，补充一个或数个SOP。临床基因扩增检验实验室的技术验收申请表后提出来的实验室所必须具有的程序文件，大部分是SOP，少部分是程序文件，对实验室 的质量手册没做要求。那么怎样来编写SOP文件呢?这一点以前有很大一部分实验室都觉得不知从何写起，希望有一个标准模式。近些年来，经过学习、思考、实践、再学习、再思考和再实践这样一个过程，全国已涌现出一批无论是在形式上还是在实质上，其SOP都具有实用性的实验室。对于SOP的编写，其实细细思考一下，你某一项检验应该怎样做才能保证质量，然后就将这些过程写下来就可以了。SOP写的具不具备可操作性的一个判断标准是，在写好后，让本实验室一个尚没有从事过SOP所述方面工作的人去实际运行，如其能按你所预想的去完成操作，并得到满意的检验结果，则该SOP就是合格的，如其在使用过程中，还要就某些细节问题来问你，则该SOP尚需完善。 其实这些SOP文件究竟采用何种格式编写并不重要，关键的是要具体，要具有可操作性，要让既使是第一次接触该SOP的人也能按其完成相关操作。一定要有这样一种观念，即SOP文件不是拿来给别人看的，而是拿来给自己实验室技术人员用的，一定要从实际出发，做得到的才写进去，做不到的就不要写进去。在一个实验室中，SOP应涵盖日常检验中各个方面，比如说每台仪器操作、校准的标准操作程序、每个项目的标本收集、保存、运送、检测程序等。可以将每一项目特定标本的收集、保存、运送等放在一个程序里来写。 从上述来看，“写你所做的”还是很容易做到的。那么难的是什么呢?难的是后面两项，即“做你所写的”和“记录你所做的”。SOP文件有了，但能不能按照其去进行每天的常规工作，除了要有严格的实验室管理制度外，关键是实验室负责人和实验室技术人员的观念和意识，要认识到SOP文件对保证检验质量的重要性，而不只是为了应付技术验收检查。质量管理不是表面文章，其精髓就是所有与实验室检验质量有关的环节全部要有章可循，并按章进行。这不但是对实验室实际操作技术人员的约束，更是对实验室负责人的约束，不能随心所欲，比如说仪器、试剂、消耗品的购买，都必须按程序进行。这是与我们传统的平常只查考勤、查卫生等到出现问题时再处罚个人的经验管理模式所完全不同的，这个观念和意识的转变首先应是实验室负责人，然后才是具体的实验操作人员。如果编制SOP或其它质量管理文件只是为了应付验收检查，那么从一开始就会觉得很麻烦，不知从何做起，在心里产生一种抵触情绪，这样的话，既使是有了装订精美的SOP文件，也只不过是供人参观的一个摆设而已。 “记录你所做的”，简单地说就是将常规工作中所做的记录下来。一般来说，临床基因扩增检验实验室需要记录的有，临床标本接收中的患者个人有关资料(如姓名、性别、年龄等)、标本接收日期、标本特性、标本的状态、标本的编号等;检测前的仪器设备和试剂的准备等;检测中的试剂生产厂家、试剂批号、检测日期、检测结果、质控结果及分析、检测 人(签字)、质检人(签字)等、检测后的实验台面、仪器设备等的消毒和清洁、紫外线照射等。一次两次的记录并不难，难的是持之以恒。上述的各个方面看起来很多很麻烦，但在具体的工作中，可采用表格的方式就一些具体的常见的情况列出来，记录时实验技术人员只要在相应的条款上打“√”即可。 至于质控结果和分析的记录，可根据实验室所采用的室内质控方法，直接在相应的质控图上记录。 分析你已做的简单讲就是，对你得到的患者测定结果进行分析后再报告，其实质也就是对检验结果的解释。应有具备一定资质和临床知识的人员，负责对测定结果做出合理的解释，当发现明显有异常结果时，应积极与临床“对话”，必要时，进行补充实验，从而找到出现异常的依据，报出正确结果。 有了管理制度，有了标准操作程序，接下来的就是要让实验室的每一个实验操作人员都知道，并遵照执行。在实验室验收时，还有一个内容就是对实验操作人员就其日常工作的有关质量管理进行口试和/或笔试，如果一个实验室操作人员对其应该遵循的管理制度和SOP 一无所知或知之甚少，这样其肯定是做不好日常检验的。 二、临床PCR实验室质量管理的特点 (一)“无基因”概念 众所周知，细菌病毒是很微小的生物颗粒，看不见摸不着，当我们在进行细菌培养时，如果没有“无菌”概念，不严格按细菌培养的无菌操作程序进行操作，就会造成杂菌污染，致使培养失败。在此，本人提出在临床PCR检验及使用基因扩增技术的科学研究中，一定要有一个“无基因”概念。也就是说，要有防止以前扩增的“基因”对现有实验的污染的概念。因为细菌病毒虽小，基因更小，PCR扩增的只是细菌、病毒或人基因组序列的一小部分，大到几百个碱基对，小到数十个，这么小的分子，可以说是无孔不入，很容易因为人员及实验物品的流动、操作的不规范而造成实验污染，出现假阳性结果。因此，在临床PCR检验工作中，工作人员必须要有这个概念，并针对其采取严格的实验室管理和程序化的室内质量控制措施，从而减少或避免假阳性结果的出现，即使出现，也能监测到，进而避免错误结果的报出。 (二)实验室要有严格的人员进入限制和程序 人员进入的无序和随意进入，是临床PCR实验室“污染”的主要原因。有了好的符合要求的实验室设置，如果没有严格的实验室管理，良好的实验室分区设计就完全失去了意义。因此，与临床PCR实验室无关的人员，在未经许多并要求准备的情况下，是不能进入实验 室的，实验室应在门口显眼的位置标识“非本实验室工作人员未经许可不得入内”的提示，人员进出可进行相应的记录。也可在实验室地面上标识不同区域的进入流向，从而清楚提示实验室技术人员在PCR实验室的工作流向。 (三)使用合格的试剂和消耗品 试剂质量是临床PCR检验质量的重要一环，每批试剂在购入后都应有最基本的质量检验。在选用某一品牌试剂时，要注重试剂盒的核酸提取方法的有效性，评价其对不同程度溶血、脂血和黄胆标本的抗干扰能力，从而确定对这些标本是否要拒收。基因扩增检验中使用的消耗品最主要的是离心管和带滤芯吸头，离心管要注意其是否含有扩增反应的抑制物，带滤芯吸头则是其密封性如何，对其质检均应有相应的具有可操作性的质检程序。这些都是为了避免出现假阴性结果。 三质量体系文件的编写 实验室“质量体系”是指实验室实施质量管理所需的组织结构、程序和资源。所有技术和管理程序以文件化的形式列出，这些文件都必须完全与实际工作相符，从而使其能以最有效最切合实际的方式来指导整个实验室的工作人员、仪器设备及信息的协调活动，保证能为患者和临床医生提供高质量的检验结果，并降低检验的经济成本。质量体系的基础是质量体系文件，是对质量体系的描述。设计质量体系和编写质量体系文件的基本原则就是“最有效和符合实际”。 (一) 质量体系文件的特性 质量体系文件主要有三大特性，即法规性、唯一性和适用性。法规性是指文件一旦制定完成并批准实施，就必须认真执行，按照相应的文件去完成日常检验工作，也就是前面所说的做你所写的。并且文件的修改不能随意，只能按规定的程序进行。唯一性则是指(1)一个实验室只能有一个质量体系文件系统;(2)一项检验活动只能有唯一的操作程序;(3)一项规定只能有唯一的理解，不产生歧义;(4)只能使用文件的有效版本，无效版本在实验室的任何地方都不能使用。适用性是指质量体系文件无统一格式;无标准文本;怎么做怎么写，切合实际，具有可操作性，不拘一格。所有文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到。当发现文件有不适合情况时，则应立即按规定程序对文件进行修改。 (二)质量体系文件的作用 质量体系文件的作用主要有以下几个方面:(1)为达到质量目标提供了一条捷径。一个实验室的质量体系文件为该实验室实现其质量目标提供了最有效和最切实可行的办法，并且人员的职责和权限以文件形式得到了确认界定，避免了扯皮，处理好了工作间的接口，使 整个实验室质量体系成为职责分明，协调一致的有机整体;“该以文件表述的一定要写出来， 写出来的一定要做到”，文件即为质量法规，通过认真执行文件来达到预定的质量目的。(2) 可作为审核的依据。文件可以证明整个检验过程是确定的，并得到了认可和实施。此外亦证 明文件的更改必须遵循一定的程序进行。(3)作为质量改进的保障。有了文件，实验室技术 人员就知道如何进行日常检验工作，管理人员也可依据相应的文件来评价工作业绩;依据文 件改进检验质量后，自然就增加了测定结果的可比性和可信度;如果将改进质量所采取的措 施再变成SOP 文件后，可使这种改进持续有效。和(4)人员培训。实验室的质量体系文件 可作为实验室全体技术人员的培训教材，不但可以作为管理方面的培训，也可以作为实验技 能的培训之用，文件是否能有效切实地用于临床标本的检验，从某种意义上说取决于这种培 训的有效性。 (三) 质量体系文件的层次   图3-5. 质量体系文件层次图 质量体系文件的层次可用一个图(图3-5)来表示。可见质量体系文件主要是由质量 手册、质量体系程序文件和标准操作程序、表格和报告等质量文件所组成的。各层次文件既 可以分开，也可以合并，当各层次文件分开时，应有相互引用的内容，在相应的文件后附上 引用内容的条目。低一个层次的文件在内容上不应与高一个层次的文件在内容上相矛盾。文 件的层次越低，则其应比高一层次的文件更具体、更详细及更具有可操作性。此外，也可将 表格、报告、记录等作为第四层次文件，与标准操作程序分开。 (四) 质量体系文件的编写 如何编写质量体系文件通常是临床PCR实验室颇感头痛的问题，因为从来没有接触过这些东西，也没想过日常的检验工作还需要那么多的条条框框来规范，故而感到没有头绪。这里先给简要介绍一下质量体系文件的编写原则和方法，后面的有关章节再针对实验室SOP 做具体介绍。 1. 质量体系文件的编写原则 (1) 系统性: 实验室在编写质量体系文件时，必须具有系统性，要将《临床基因扩增检验实验室技术验收表》中的全部要素、要求和规定，有系统和有条理地编制成各项制度和程序。所有文件应根据其应用分类编辑成册，以便于应用。各层次文件要分布合理、数量充分，不但是相互独立的，而且要相互协调和相互印证，承上启下。 (2) 协调性:质量体系文件之间应相互协调，具有一致性。各项程序文件应与有关检验的技术标准和规范相一致。认真处理好各种接口，避免职责不清及出现不协调的情况。 (3) 唯一性:质量体系文件对于一个实验室来说，应该是唯一的，这种唯一性表现在如下几个方面，一是一个实验室只能有一套质量体系文件;二是一项技术工作只能有一个程序文件;三是对特定文件的解释理解只能有一个，这就要求编写文件时，表述要清楚、准确和全面。 (4) 适用性:这一点前面在叙述质量体系文件的特性时已谈到。再重复一下其基本内涵，就是实事求是，以最佳和最符合实际工作的方式编写文件，要确保文件的规定在实际工作中能完全做到，这就要求在编写文件时，不但要依据《工作规范》和《临床基因扩增检验实验室技术验收表》中的要求，而且要根据实验室的实际情况来进行。一旦在实际日常检验工作中，发现文件与实际工作的要求有不符合之处，则应立即对文件按规定程序进行修改完善。 2. 质量体系文件的编写方法 (1) 自上而下编写法:按照图3-5的文件层次，采取自上而下即质量手册、程序文件、标准操作程序、表格、记录等顺序编写。这种编写方法可使上一层次文件与下一层次文件有较好的衔接。这种编写方法对文件编写者，不但要求有较好的实验室质量管理方面的知识，而且要求其还要有较高的临床实验室专业知识水平。由于具有这两方面知识的人员较少，因而需要边学习边进行文件的编写，文件编写的时间可能要长一些，并且通常会有反复的修改。 (2) 自下而上编写法:按照图3-5的文件层次，采取自下而上即标准操作程序、程序文件、质量手册等顺序编写。这种方法适用于原管理基础较好的实验室，但应设计有一个文件 总体方案，以指导文件的编写，否则易出现混乱。 (3) 上下延伸编写法: 按照图3-5的文件层次，采取先编写程序文件,再编写质量手册和标准操作程序、表格、记录等的方式进行。这种编写方法是通过先分析实验室的各项管理和技术工作，确定如何进行这些工作后的一种较好的编写模式，有利于将《工作规范》和《临床基因扩增检验实验室技术验收表》中的要求与实验室的实际工作相结合。 (五) 质量体系文件的编写要点 1.质量方针:质量方针的编写要点简单说，就是个性化、易于理解和执行。个性化就是其要体现特定实验室的质量目标以及患者和医生的期望和要求，其所表达的是实验室对检验质量的态度和对质量的承诺。易于理解就是要求描述质量方针的文字精练、准确、易记和通俗易懂。质量方针尽管文字很少，但内涵应是丰富的。如卫生部临床检验中心(以下简称部中心)的质量方针是“科学、公正、准确、及时、有效”，这十个字既是部中心的质量目标、质量态度和对质量的承诺，也是被检个人和单位的期望和要求。但要做到这十个字，则需要采取一系列的有计划的和系统的措施。 2.质量手册:质量手册包括质量方针、组织结构、人员职责以及质量体系要素的描述。质量方针的编写前面已有叙述。组织结构可以一个结构图来表示，表明各部门之间、上下之间的关系，所有与质量有关的职责都要有相应的部门或人员来承担，各部门和各类人员的职责和权限应清楚明了，职责的界定无漏项、无重复。文字编写要求准确、精练和通顺，并注意逻辑性和活动顺序。质量手册的编写格式要考虑文件的修改、改版和使用。 3.程序文件:程序文件的内容包括责任、完成活动及验证的方法和有关的记录等。编写应遵循如下几个原则，一是“最佳和最符合实际的原则”，编写的实验程序方法应是最佳、最符合实际的和可行的，一定要注意文件的可操作性。二是“5W+1H原则”，5W即What(做什么);Who(谁做，即责任人)，Where(做的地方)，When(做的时间)和Why(为什么做)。1H即How(怎样做，依据什么，用什么方法)。也就是在一个程序文件里，所应表述的基本方面。已确定的人员职责在相应的检验活动中都要有相应的体现，活动中的每个环节都应有人承担责任。工作活动的交叉部分也应有明确的表述，相关的职责应予明确。此外，与质量手册一样，文字编写也要准确、精练和通顺，并注意逻辑性和活动顺序。编写格式要考虑文件的修改、改版和使用。 4.标准操作程序(SOP):SOP的基本内容与程序文件类似，只不过要求更详尽更具体，对工作的覆盖面相对较窄,下面会有一些详细介绍。 (六) 如何编写SOP和设计实验记录表格 从图3-5可见，如果将实验室质量管理文件比作一座山，质量手册就是这座山的山峰，可以登高望远，从某种意义讲，质量手册主要是给实验室以外的人看的，它彰示了这个实验室的法律地位、质量方针、质量目标、组织结构及相互关系。质量体系程序文件则是这座山的山腰，具有承上启下的作用，其依据质量手册对各种与质量有关的活动的规定和关系，对实验室的共性的和一个方面的工作做出程序规定，为下面的SOP的编写，提供了一个原则框架和指南。而SOP和实验记录表格等则是这座山的山脚，它的量是最大的也最具体，从临床实验室的具体工作来看，也最容易把握，“千里之行，始于足下”，那么我们就从山脚下开始走起。临床PCR实验室验收对实验室质量体系的要求，最主要的也就是SOP和实验记录表格的编写和实施。 那么，到底SOP和实验记录表格应该如何编写?前面说了，就是怎么做怎么写，怎么做怎么记。下面会针对临床PCR实验室的特点及一些实例进行具体解释。图3-6所示是一个实验室SOP编写的格式及基本内容。 1.SOP的编写 SOP的编写格式并不重要，重要的是它的内容，首先是要目的明确，即为什要编写该SOP，其是为了规范一项什么的工作程序，保证一个什么样的结果，如仪器设备的正确操作、良好运行，标本采集、运送和保存对检测的有效性等。第二个就是要确定其适用范围，也就是说，该SOP适用于哪些工作内容，以保证其不用于不适当的地方。SOP还有一个非常重要的地方，是必须要确定责任人，即在这个实验室里会有哪些工作人员在其日常检验工作中会用到这个SOP，在该处可以让每个责任人签字确认。操作步骤是整个SOP的核心和灵魂，在编写时，应越具体越好，通俗的讲，就是在编好一个SOP后，让另一个人按照进行操作，应可以在保证得到一个好的结果的条件下完成。如果其在操作过程中，有不清楚的地方，仍需要问你，则该SOP就不是一个好的SOP，就需要重写。反复这样几次，相信就可以得到一个具有实际可操作性的SOP。最后就是关于SOP的改动。SOP一旦形成以后，是不能随意改动，在工作中必须严格按照相应的SOP去做，既使你认为SOP有问题，在改动之前，也必须按照你所认为的“错”的去做。只有经过有组织的讨论确认以后，才能按讨论结果予以改动。在这里，通常可以下述方式进行叙述:当该SOP具体使用者在实际工作中，发现该程序有不正确或不完善处，则应向XXX(通常为该SOP的批准人)提出，由其召集与该SOP 有关的所有责任人讨论，确认后再决定是否改动，如有改动，则形成新的一版SOP，有关责任人重新签字确认后实施。  图3-6. SOP编写的格式 2.临床PCR实验室有关具体SOP的编写要点 临床PCR实验室的日常工作通常要涉及到:(1)实验室的清洁;(2)生物安全防护;(3)仪器设备的维护和校准;(4)仪器设备的操作;(5)临床标本的采集、运送、接收和保存;(6)试剂和消耗品的质检;(7)项目检测、结果判断解释和报告;(8)实验记录及其管理;(9)室内质量控制;(10)室间质量评价;(11)投诉处理等。下面分别就其编写的基本要点进行讨论。 (1)实验室清洁:实验室清洁的SOP编写的目的无非是为了使实验室台面、地面和 仪器设备在实用后，处于洁净和无感染性状态，以防止出现因仪器设备不洁影响检测或仪器使用寿命;防止因实验室台面、地面和仪器设备的生物传染危险性造成实验室人员感染，以及防止实验室交叉污染而出现假阳性结果等。其适用范围应包括实验室地面、台面和仪器设备等的清洁。责任人应包括可能会从事地面清洁的临时工在内的所有会用到该SOP的实验室人员。具体的操作步骤至少应包括下述基本点:①按实验室台面、地面和仪器设备分开来写各自的具体清洁方法，要具体而又有可操作性，实验室台面、地面和仪器设备的清洁程序包括用品应该是不一样的，各有其独特性，所以应分条目单独编写，并且仪器设备也各有不同，如扩增仪、加样器、离心机、恒温器、生物安全柜等，清洁又各有其特点，所以仪器设备的清洁应根据具体仪器设备来写。当然如果仪器设备的日常清洁程序放在他处如仪器设备的维护程序内，则可指明特定仪器设备的清洁见哪一个特定的程序即可，不必重复叙述;②应规定工作人员在清洁时，必须按试剂准备区→标本制备区→扩增(及产物分析)区方向进行，不得逆行;③规定每一工作区域的清洁必须使用专用的清洁用具，不得混用。④规定有潜在生物传染危险性材料溅出时的消毒清洁方法。 该程序编写普遍存在的问题是:①没有规定具体的责任人。实验室的操作台面、地面和仪器设备可能是由不同的人员负责，应明确责任人，并在实际工作中，对有关责任人进行实验室管理方面的培训。②清洁只是对实验室台面和地面，仪器设备要么只有加样器、离心机等一到两种，要么根本就没有涉及。③清洁操作步骤过于原则，不具体。如清毒剂的消毒没有规定时间，清洁的各步骤之间没有连惯性，紫外照射没有时间等。④没有规定工作人员清洁时的工作流向。⑤没有规定清洁各实验区域必须使用其专用的清洁用具。⑥没有考虑有潜在生物传染危险性材料溅出时的消毒清洁。 (2)生物安全防护:实验室生物安全防护应该包括两个大的方面的内容，即实验室工作人员的生物安全防护和对环境的生物安全防护。实验室生物安全防护SOP编写的目的是，通过确定工作中生物安全个体防护设备和用具的正确使用，保证实验室工作人员在日常检验工作中，尽可能不受具生物传染危险性实验用品的感染，以及确定意外情况下的处理程序，保证出现意外的实验室工作人员能得到及时有效的咨询和处理。通过确定实验室有潜在生物传染危险性废弃物的处理程序，保证实验室外环境不受实验室内具潜在生物传染危险性的物品的威胁。其适用范围应包括实验室内所有涉及有潜在生物传染性物品和材料的区域和操作步骤。责任人应包括指定的实验室生物安全负责人和可能会接触到有潜在生物传染性物品和材料的实验室工作人员。具体的内容应包括:①明确规定实验室工作人员在进行哪一类接触到有潜在生物传染危险性的物品和材料时，应使用哪类个体生物安全防护设备和用具，如生 物安全柜的使用、穿什么样的隔离衣、戴什么样的帽子和什么样的手套、使用什么样的口罩，还有眼罩和面罩等;②制定实验室内锐器物品的使用规则;③制定发生意外如手指划破、血清溅入眼内等情况下的处理程序，包括初步处理、所接触临床标本的生物传染性确认、进一步的措施(疫苗免疫、药物阻断、定期监测等)。④明确有潜在生物传染危险性的废弃物(包括废弃临床标本)拿出实验室前的消毒方法如高压或化学消毒。 该程序编写普遍存在的问题是:①没有指定实验室生物安全负责人。②对实验室工作人员在处理有潜在生物传染危险性物品时，个人防护设备的使用规定不具体，通常只是简单的叙述:要穿隔离衣、戴手套和口罩等。至于穿什么样的隔离衣(前开还是后开?如何与通常的工作服区分等)、戴什么样的手套(乳胶还是塑料?)和口罩(纱布、纸的还是N-95?)则没有规定，显然不具备可操作性。③没有制定锐器的使用规则。④对出现意外情况下的处理措施不彻底，比如，实验中手的意外划破，处理方法通常只是叙述:先挤压，再用碘酒和75%酒精消毒。血清溅入眼内，也只是简单的用生理盐水冲洗。至于，是否要确认所接触标本的传染性，如何确认，及进一步措施的采取，如向谁咨询、疫苗免疫、药物阻断等，则没有说明。⑤没有规定有潜在生物传染危险性的废弃物(包括废弃临床标本)拿出实验室前的消毒方法，或是方法不具体，如是高压消毒，还是化学灭活。 (3)仪器设备的维护和校准:仪器设备的维护和校准的SOP应包括一大类，维护的SOP会涉及到几乎所有实验室的仪器设备，如扩增仪、加样器、恒温仪、冰箱、生物安全柜、离心机、振荡器、超净工作台、可移动紫外灯、酶标仪、洗板机等。校准的SOP则只涉及扩增仪、加样器、温度计和酶标仪(如用到)，这四种仪器可将校准和维护的SOP写在一起。要注意的是，最好是每种仪器设备单独写一个SOP。编写仪器设备的维护和校准的SOP的目的是，通过定期对特定仪器设备的维护和校准，保证仪器设备处于运行良好的状态，从而保证检验结果的准确性。其适用范围如为一个仪器一个SOP，则单指该仪器，如为多个仪器一个SOP，则将所有涉及仪器列出。责任人如果是维护则包括所有会用到该仪器设备的实验室工作人员，如果是校准，则要看校准的实施者是谁，如仪器设备的生产或销售商、国家计量部门、实验室工作人员自己等。一个符合要求的仪器设备维护和校准SOP 具体操作步骤至少要包括下述基本点:①维护和校准的基本方面:光路、滤光片、波长、加热模块的清洁、具体的校准点选择(如加样器的校准体积点选择、温度计的校准温度点选择等)、维护和校准的具体方法包括用具。②校准合格的判断标准。③维护和校准的间隔时间，如一周、一个月、三个月、半年等。 该程序编写普遍存在的问题是:①责任人没有明确。这一点在校准程序上尤为明显。 有同道说:校准是由计量部门或是厂家进行，所以没写。如果是由厂家或计量部门进行，责任人即为他们，在SOP里面同样需要明确。同时，实验室工作人员亦应为责任人，其职责是监督和确认仪器设备是否按程序进行了校准，并确认其是否达到了合格的标准。②没有具体的校准方法或步骤。通常大家都认为，仪器设备由厂家或计量部门校准，不知道校准的方法和内容。其实，尽管校准不是由实验室进行，但实验室之所以要校准，其根本目的不是为了通过某种认可或验收，目的只有一个，那就是保证临床PCR检验的质量。因此，对于校准的内容和具体方法，实验室有必要了解和明确。校准的具体方法和内容可通过由有关厂家提供、咨询计量部门或查阅有关标准获得。通常国家计量部门的校准方法是根据相应的国家或行业标准进行的。③没有相关仪器设备校准合格的判断标准。此类标准通常可通过查阅仪器设备的说明书解决，也可咨询相关厂家或查阅有关国家或行业标准。④没有维护和校准周期。 (4)仪器设备的操作:仪器设备的操作的SOP同样应包括一大类，亦应涉及到几乎所有实验室的仪器设备。编写仪器设备操作SOP的目的是，保证仪器设备的正确操作和使用。每台仪器设备的操作SOP的适用范围就是其本身的操作。责任人包括所有会用到该仪器设备的实验室工作人员。编写仪器设备操作SOP的要点就是按照每台仪器设备的使用说明书，将其详细操作步骤包括开机关机次序、编程、调试、运行、计算等按实际使用中的先后顺序逐项列出，最后还应有使用的注意事项。 该程序编写可能普遍存在的问题是:①责任人没有明确。②仪器操作各步骤出现逻辑混乱，步骤都有，但与实际操作先后有差异。③关键的注意事项说明不够。 (5)临床标本的采集、运送、接收和保存:临床标本的采集、运送、接收和保存的SOP也包括一大类，每类标本乃至每个项目的特定标本如血清、血浆、分泌物、尿液、痰、脑脊液、胸腹水、组织等，都应有一个采集、运送、接收和保存的SOP。编写该项SOP的目的是，通过规范相应临床标本的采集方法、所用容器、运送方式、保存条件及接收规则，保证相应临床标本的正确采集、运送和保存，从而确保所采集的标本在检测前的有效性。适用范围则根据其所适用的特定的检测项目确定。责任人包括所有涉及到标本采集、运送、接收和保存的人员，如医生、护士、护工、实验室技术人员等。临床标本的采集、运送、接收和保存的SOP应包括如下基本内容:①特定标本采集的具体方法步骤。②明确规定标本的采集容器要求。③明确标本的采集量。④明确标本采集后送到实验室检测所能容许的最大时间间隔，亦即标本采集后，应在多长时间内送至实验室。⑤明确标本采集后，在送至实验室检测前的保存方式和条件。⑥明确标本从采集处运送至实验室过程中所要求的运送条件。⑦ 明确标本接收时，签收的程序、拒收的标准和标本唯一编号的规则。⑧规定标本在实验室内的短期(应有具体时间)和长期(应有具体时间)保存条件和要求。⑨制定保证标本安全，即如何防止标本丢失、掉换、变质的措施。 该程序编写可能普遍存在的问题是:①责任人没有明确。通常，临床实验室认为，标本不是由本室采集，因而也就没有明确。不管标本是不是由本室采集，都必须明确责任人。 ②标本采集方法不具体，尤其是分泌物、痰等标本的采集。尽管标本大都不是由实验室本身采集，而是由护士或医生采集，在SOP里面也必须写出标本采集的具体方法，并作为培训有关标本采集人的依据。至于培训的方式则可多种多样，面对面继续教育、发放小册子等均可。③对标本的采集容器规定不明确。如只说是真空采血管，但真空采血管有好多种，到底是哪一种应该明确。④没有指明标本采集的量。⑤没有明确规定标本采集后，送到实验室的时间，而只是说尽快送到。⑥没有规定标本采集后在送到实验室之前的保存条件和要求。 ⑦没有规定标本的运送条件和要求。⑧标本拒收的标准过于原则，如有的实验室规定标本在下述情况下应拒收:未使用正确容器的、抗凝剂不正确的、标本量不够的、标本采集后送到实验室超出规定的时间的、溶血、脂血等。这样的规定就太过原则，如改为下述就较好:未使用无菌的不含任何添加剂的真空采血管、使用肝素抗凝的、标本量少于2ml的、标本采集后送到实验室时超出2小时的、重度或中度溶血的、脂血的。⑨标本的唯一编号方法中，无检验项目的区别。通常，可以采用英文字母来解决，如B05090101可表示为HBV DNA 在2005年9月1日的第一号标本，相应的可用C表示HCV RNA，I表示HIV RNA等。⑩没有保证标本安全的措施。绝大部分实验室很少想到这一点，其实具体的措施也不复杂，无非就是标本由专人负责保管和取放、保存标本的冰霜本身带锁或放在有锁的房间内等。 (6)试剂和消耗品的质检:在临床PCR实验室，需要质检的试剂和消耗品主要也就是特定的商品或自制PCR试剂、提取用eppendorf离心管、带滤心或不带滤心吸头等。编写试剂和消耗品质检的SOP的目的是，通过对试剂和消耗品的质量检验，发现存在问题，避免将有问题的试剂和消耗品用于日常检验工作，从而保证用于日常检验的试剂和消耗品的质量。其适用范围可将特定的试剂和消耗品的名称如HBV DNA实时荧光PCR试剂盒、HCV RNA实时荧光RT-PCR试剂盒、本室使用的eppendorf离心管、带滤心或不带滤心吸头等列出。责任人则为可能会使用到这些消耗品的所有实验室工作人员。试剂和消耗品质检SOP 中质检的具体操作步骤应包括如下基本内容:①试剂质检的基本方面，如试剂的抗干扰能力(主要是针对提取试剂)，即对溶血、脂血标本扩增抑制作用的了解。可通过自行制备含已知量病毒核酸的不同程度溶血或脂血的标本进行质检。如为定量检测试剂，还应包括检测的 重复性、线性范围等的质检，通常使用2-3份样本进行检测即可。如为定性检测试剂，则应重点考察测定下限，可用系列稀释的含已知量靶核酸的血清标本进行。②核酸提取用离心管质检的基本方面:离心管在内含水溶液加热时，管盖的密封性;高速离心时，离心管的完整性和扩增抑制物的质检。最核心的是离心管的扩增抑制物的质检(尤其是使用国产离心管时)，应说明抽取多少支，用什么浓度的样本，合格的判断标准等。因为目前国内HBV DNA 的检测，在核酸提取时，多采用煮沸裂解法，因此，还应考察离心管在加热时的密封性。核酸提取通常会涉及到高速离心，应抽取一定数量离心管，在其内含一定量液体时，进行高速离心，从而判断离心管在高速动转下的完整性保持情况。③带滤心吸头的质检主要是滤心的密封性，可采用含1~2%甘油的有色溶液来进行质检，具体的质检方法参考有关教材[1]。④吸头的抑制物的质检可参考离心管抑制物质检方法。要说明一点的是，如果购买的是不含任何DNase和RNase的离心管和盒装带滤心吸头，则无需进行抑制物质检，可直接使用。 该程序编写普遍存在的问题是:①对试剂的质检方法过于繁琐。②无对离心管所含抑制物的质检方法，只是关注密封性和离心耐受性的质检。③对消耗品如离心管等数量的选取过多。④带滤心吸头质检的方法不具体等。 (7)项目检测、结果判断、解释和报告:项目检测、结果判断、解释和报告的SOP 也包括一大类，每一个检测项目都应有一个此类SOP。该SOP编写的目的是，通过规范特定临床检验项目的标本检测、结果判断和报告过程，保证相应项目检验结果的准确性和重复性，以及在不同实验操作人员间的一致性。适用范围则可为特定的检验项目。责任人包括所有会用到该SOP的实验室工作人员。一个完整的项目检测、结果判断、解释和报告的SOP 至少要包括如下基本内容:①标本进入实验程序后的操作编号方式。②根据所用试剂盒确定的详细操作流程。③仪器编程及文件名的编写规则。④结果判读的流程和规则。如实时荧光定量PCR，扩增完成后，首先观察扩增曲线，依据是否有典型的扩增曲线来进行定性结果判断，并观察标准曲线是否正常。然后选择阈值线，进行线性回归分析，确定标准回归曲线斜率、截距和相关系数的变化允许范围等。⑤结果分析解释的流程。⑥结果报告流程。 该程序编写普遍存在的问题是:①没有规定标本进入实验程序后的操作编号方式。这一点尽管只是一个过程，但实际上是非常重要的，一个规范的实验室，进行同一项目检验的每个工作人员应该遵循相同的实验编号规则，如核酸提取用离心管的号码编写位置、如何编号等，这样就可以在程序上，尽可能避免标本发生混淆。②将所用试剂盒说明书中提出的标本的采集方法写出，并且常与已有标本采集程序还不一致。如果在该程序中仍想将标本采集及处理方法列出，则可用见哪一程序(将程序编号列出)形式写出即可。③无电脑中编程的 文件名起名规则，电脑程序中通常无标本的唯一编号。④结果判读的流程和规则不清。没有规定标准回归曲线斜率、截距和相关系数的变化允许范围等。允许范围的确定可根据自己实验室一定时期内已有数据，经过充分分析来确定。⑤无结果分析解释的流程。结果分析包括两个方面，一是整批实验结果的全面分析，一是单个标本结果的分析。整批实验结果的分析包括阴性和阳性结果出现频率是否异常，是否有强阳性标本后即有较弱阳性标本出现的情况以及质控结果的有效性判断等。单个结果的分析则是对每一份标本的结果进行分析，根据临床诊断提示、相关特异抗原和抗体测定结果等，发现问题即应与临床及时对话，找出发生问题的原因之所在。⑥没有结果报告流程。所谓结果报告流程就是一份检验报告从得到原始数据到最后形成可发出报告的整个过程。在对标本的检测数据分析形成结果后，如何填写报告单，报告单必须填写的基本内容，由谁复核，如何提出临床或进一步的检测建议等应有一个基本规则。 (8)实验记录及其管理:实验记录及其管理SOP编写的目的是，通过确定实验室日常检验记录基本内容、记录方式和管理，保证日常检验记录能作为实验室检验结果的有效证据，也是实验室长期分析其检验结果变化趋势，发现潜在问题的原始资料。其适用范围应该包括特定实验室的所有检验项目的检测过程和结果;仪器设备的操作、维护和校准过程和结果;实验室环境条件的维持和检验实施时情况的记录;试剂和消耗品的质检过程和结果等。责任人应包括会涉及到日常检验工作的所有实验室工作人员。日常检验记录的管理则应指定专门的责任人。实验记录及其管理SOP的基本内容应包括:①日常检验过程中应记录的基本内容的规定，如仪器设备操作、维护和校准过程及有关数据;检验试剂来源和批号;检验标本的来源和唯一编号;试剂的配制;实验环境条件的控制记录;实验室清洁的记录;质控的记录;原始检测数据及其推导记录等。②对实验记录者的签名方式的规定和要求。③实验记录管理的基本方面:指定专门的管理人;有专门的保存处如柜子等;记录的登记归档方法;记录的借阅及销毁记录;记录保存的时间;电子记录的备份保存具体方法及保存时间等。 该程序编写普遍存在的问题是:①对日常检验中工作人员应记录的基本内容没有规定或规定不详细。②没有规定实验记录者的签名方式，即是否要手签、是否要签全名等。③实验记录管理方面的问题是:没有指定专门的管理人;没有专门的保存用柜子;没有记录的登记归档;没有记录的借阅及销毁记录;记录保存的时间规定不确切;没有电子记录的备份保存具体方法及保存时间等。 (9)室内质量控制:室内质量控制SOP编写的目的是，通过对实验室室内质量控制的规范化和程序化，监测实验室每批实验间结果的重复性，并依其决定当批检验结果的有效 性，报告能否发出。适用范围应包括所有临床检验项目。责任人应包括涉及日常检验的所有工作人员。一个完整的室内质控SOP应包括如下基本内容:①明确室内质控物的来源及浓度。如为自制，则应说明其制备方法、稳定性和管间差异的评价方法及合格条件，同时应说明量值可溯源至何种参考方法或国家和国际标准品。室内质控物还应包括阴性质控。②明确所选用的质控方法。如20次日常检测完成前，选用“即刻法”，20次后，采用L-J质控图法。 ③明确失控的判断标准或所采用的失控规则。如阳性质控样本出现假阴性、阴性质控样本出现假阳性、定量测定的13S规则等。④明确失控后的分析及处理措施。即出现假阳性和假阴性后，如何分析假阳性和假阴性出现的原因(可以写出分析证实失控原因具体实验步骤)，如何针对性的采取措施，包括再检测的实验设计等。分析失控的步骤应尽可能具体。实际工作中，一旦出现失控，实验室工作即可以遵循此程序，去分析并发现失控的原因，采取正确的处理措施。 该程序编写普遍存在的问题是:①责任人不清。②质控物的来源及浓度不清或不全，并且通常没有说明阴性质控物的来源。有些是自制，但制备方法不规范，没有任何的质量检验，定量结果没有溯源性。③没有明确所选用的质控方法。对前20次的测定的室内质控没有解决方法。④没有明确的失控判断标准，只是做了一些失控的含糊叙述。并且一般都没有阴性失控的判断方法。⑤没有失控后的分析及处理措施。 (10)参加室间质量评价:编写实验室参加室间质量评价SOP的目的是，规范实验室对室间质量评价样本的接收、处理、保存、实验编号、检测、结果解释报告以及对返回结果的分析，监测实验室在测定准确度上存在的问题，以采取相应措施加以改进。适用范围应包括所在有参加室间质评的检验项目。责任人包括所有的会涉及室间质评样本接收、处理、检测和报告的实验室工作人员。一个较完善的参加室间质量评价SOP的基本内容应包括:①明确规定室间质评样本的接收记录方式、保存条件及实验编号规则。②明确室间质评样本的检测流程，要强调的是，室间质评样本应以与临床标本相同的方式处理和检测。③明确室间质评样本的报告流程，即填写、复核和签发如何进行，由谁负责。④明确对返回结果的分析流程和责任人。⑤明确室间质评检测失败的原因分析流程，包括必要的实验证实的具体方法。 ⑥明确如果测定准确性出现问题后，如何针对性采取措施的流程。 该程序编写普遍存在的问题是:①责任人不清。各个环节都应有相应的责任人。②没有明确规定室间质评样本的接收记录方式、保存条件及实验编号规则。③没有明确室间质评样本应以与临床标本相同的方式处理和检测。④没有明确的室间质评样本的报告流程。⑤没有对返回结果的具体分析流程。⑥没有室间质评检测失败的原因分析流程。⑦在测定结果有 问题时，没有针对性采取措施的流程。 (11)投诉处理:编写投诉处理的SOP的目的是，通过规范对投诉的处理流程，妥善处理实验室与临床医生和患者的可能发生的对检验结果或其他方面的不满意或疑问，缓解关系，并通过这种流程的规范，从投诉中发现自身实验室存在的问题，采取措施加以改进，及时准确的为临床医生和患者提供检验报告。适用范围应包括检验结果、服务态度、检验时间、检验项目的设置等。责任人应包括所有实验室工作人员。一个较为全面而又有可操作性的投诉处理的SOP至少应包括以下基本内容:①明确投拆第一接触人对投拆的处理流程，即如何记录、如何针对相关投诉的进一步处理程序、是否需要报告和如何报告、以及如何向投拆人返回处理意见等。可将投拆分为不同类如对检验结果正确性、服务态度、报告单填写错误等分别编写处理流程。②投拆有效时的如何改进和采取何种措施的具体流程。应非常具体并具有可操作性。 该程序编写普遍存在的问题是:①责任人不清。也就是说，什么层次的人应该负责什么样的投拆的处理不清楚。②对投诉的处理流程过于原则。应该尽可能具体，在编写时可以假定各种投诉的情况，设想在此种情况下的具体处理流程应该是什么样，将其写下来，再进一步审核确定。③对投诉没有进行分类分别设定处理流程。因为不同类的投拆处理的复杂程度是有差异，有些还较大，因此，进行必要的分类，有助于投诉的及时有效的处理。④没有对投拆有效时如何改进和采取何种措施的具体流程。 以上对十一个方面的SOP的编写要点进行简要叙述，提出的只是基本点，细节还需要我们每一位同道根据自己实验室的具体情况去制定。此处，仍想强调一点的是，SOP不是给实验室的人看的，是指导实验室日常工作的指南，一定要有可操作性，并在实际工作切实遵照执行，保证我们临床检验工作者的产品--检验报告单的质量。这也是SOP编写的真正目的之所在。 3.临床PCR实验室实验记录表格的设计 一个PCR实验室的日常检验记录通常包括离心机、生物安全柜、恒温仪、扩增仪等仪器设备操作、维护和校准过程及有关数据;检验试剂来源和批号;检验标本的来源和唯一编号;试剂的配制;实验环境条件的控制记录;实验室清洁的记录;质控的记录;原始检测数据及其推导记录等。这些实验记录初看起来很多，再加上PCR实验室的分区，实验室通常会感觉记录太复杂，难以做到。有这种感觉并不奇怪，如果要求记录完整，上述记录可能需要很多的记录本，并且非常散，既难以持之以恒，也不易归档保存，发生问题需要查找时，也极不方便。如何将实验记录既记录完整，又简单并查找方便是一个值得思考的问题。 临床检验的特点，就是每天都在重复着相同的实验和相同的实验过程，因此，对实验流程的记录至少在一段相对较长的时间内应该是相同的，除非在试剂方法上有大的更换。实验记录要求的是完整而又有效，具有对试剂、人员、检测标本、质控、仪器状态的回溯性，因此，将每天重复的工作流程以文字形式例出，前面留一方框即“ ”，做完后在“ ”内打“√“即可。 图3-7所示是一份临床PCR实验室的记录表格，其特点是将PCR整个实验流程及不同区的仪器设备操作、实验室环境状态(温湿度)、实验室清洁等放在了一张实验记录表上，简单而又有效，实验室记录表最后可与打印出来的原始数据和结果保存在最后一个区内，归档保存和查找都相当方便。 至于阳性质控样本的室内质控图需单独绘制，每月一张，然后与相应的多次“临床PCR 检验流程记录表”一起归档保存。如有严重的失控发生，则失控原因的分析及实验验证过程可用单独的记录表格，然后再将这些记录表与上述检验流程记录表一起保存。 此外，保存试剂和临床标本的冰箱温度也可单独记录，现已有一些计算机软件，可通过联网对冰箱温度进行实时监测和记录，这样就不必在此流程表上记录。 临床PCR的记录除了上述以外，还有一个很重要的记录就是临床标本的接收、编号和拒收，该项记录应在标本接收区内完成，也可通过设计相应的表格来完成。如图3-8所示的范例，其包含所有接收时应记录的基本内容。对于标本拒收的记录,也可设计相应的表格(图3-9)。 图3-7.临床PCR实验室的检验流程记录表示范 图3-8. 临床PCR实验室标本接收记录表示范 图3-9 临床PCR实验室标本拒收记录表示范 第三节临床PCR实验室验收与实验室认可之间的关系临床PCR实验室在质量管理体系的建立上，遵循了一般的实验室质量管理基本原则，与所有实验室质量管理体系都不矛盾，只要是有利于实验室规范化管理的规则，全部适用于临床PCR实验室。但近年来，临床实验室认可亦正成为许多国内大医院临床实验室正在追求的一个目标，此处，对实验室认可与临床PCR实验室验收之间的关系作一阐述。 一、实验室认可的由来及目的 实验室认可因国际贸易而生，当一个国家或地区的商品需要进入另一个国家或地区时，需有相应的质量检验证明，但不同的实验室常缺乏一致的标准和手段，使得检验结果不一致，引起贸易磨擦。二十世纪四十年代末，为能给二次世界大战盟军提供军火，澳大利亚建立了世界上第一个国家实验室认可体系，以澳大利亚国家检测机构协会(NA TA)作为其认可机构，以保证不同的实验室具有相同的检测标准和手段。到六十年代，英国率先在欧洲建立了国家实验室认可机构，其后，美国、新西兰和法国等在七十年代，东南亚各国在八十年代相继建立了实验室认可机构。到九十年代，我国及一些发展中国家也加入了实验室认可行列。世界各国为了资源共享，检验结果互认，形成了以亚太实验室认可合作组织(APLAC)、欧洲实验室认可合作组织(EA)、美洲认可合作组织(IAAC)和南部非洲认可发展区(SADCA)等区域组织组成的国际实验室认可体系-国际实验室认可合作组织(ILAC)。CNAL为ILAC 和APLAC的正式成员，已与国际上30来个经济体的40多个认可机构签了互认协议[1]。临床医学实验室认可的发展历程，与上述整个实验室认可基本上差不多。因此，从实验室认可的最初目的来看，是为了保证不同实验室检测结果一致性，并通过协议使不同国家或地区的实验室检测结果能够互认，避免重复检测，降低成本，简化程序，极大的促进了国际贸易的有序发展。发展到今天，实验室认可又具有了一定程度的能力证明作用，因为依据相关标准的质量体系的建立和实施，从程序上，保证了检测结果能满足准确和及时的质量要求。 依据ISO标准进行认可,一般都属于自愿的。还有一种就是以法律为依据的强制性认可，如美国政府以法律形式颁布的于1992年正式实施的《临床实验室改进法案修正案》(Clinical Laboratory Improvement Amendment 88, CLIA88)，其对临床实验室进行了分级，提出了相应要求[10]。美国CAP(College of American Pathologists, CAP)依据CLIA88，参照美国国家临床实验室标准化委员会(National Committee of Clinical Laboratory Standardisation, NCCLS)制定的标准和指南，自行制定了认可标准。 二、实验室认可与认证的区别 实验室认可就是权威机构对实验室有能力进行规定类型的检测和(或)校准所给予的一种正式承认。实验室认证则是第三方依据程序对产品、过程或服务符合规定的要求给予书面保证(合格证书)。二者的主要区别是:(1)对象不同。前者是各类检测和(或)校准实验室，而后者是产品、过程和服务。(2)依据不同。认可依据的是ISO/IEC 17025和ISO15189等，而认证依据的是ISO 9000族等。(3)实施的部门不同。认可由权威机构进行，而认证由第三方进行。(4)认可是正式承认，认证是书面保证。(5)认可是证明具备能力。认证是证明符合性。 三、临床PCR实验室验收与实验室认可的关系 (一)所用标准的差异 国内的实验认可的执行机构是中国实验室国家认可委员会(CNAL)，较早的依据是ISO/IEC导则25:1990(校准和检测实验室的通用要求)。由于ISO 9000系列标准的较大修改，后来对ISO/IEC导则25相应进行了修改，形成了ISO/IEC17025，导则变为了完全与ISO 9000:1994标准兼容的正式国际标准。ISO/IEC 17025针对的是一般意义上的校准和检测实验室，而非临床医学实验室，因此，临床实验室采用该标准进行认可，在方法、溯源性和检测不确定度上均存在不少问题。2003年有关《医学实验室-质量和管理要求》(ISO15189-2003)发布，作为医学实验室质量管理的专用标准，后由CNAL将其直接转换为我国的国家标准，并作为国内对医学领域实验室的认可准则。 与实验室认可不同，临床PCR实验室验收的标准是2002年卫生部下发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号)和随后卫生临床检验中心发出的配套文件《临床基因扩增检验实验室工作规范》(卫检字[2002]8号)。 (二)强制性和自愿的差异 基于《医学实验室-质量和管理要求》(ISO15189-2003)和ISO/IEC导则25:1990(校准和检测实验室的通用要求)的实验室认可是建立在自愿的基础上的。也就是说，一个医学实验室如果不是为了某个特定的目的，如向委托方证明自己的检测能力、满足检测委托方的要求等，则实验室为了保证日常检验质量，可按认可中要求的去建立质量管理体系并实施，但不必去认可。而《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号)中的规定，则是要求临床PCR实验室必须要做到，带有强制性。两者的目的有着根本的区别。需要说明的是，实验室认可与《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号)之间并无矛盾，只是前者更多的强调文件化的管理，较之后者在质量体系要求上更为具体。后者则有许多则体现在政策层面上，更原则一些，有些内容如实验室准入、实验室设置和仪器设备配备、质控的要求等在实验室认可中不涉及或不做强调。 主要参考文献 1申子瑜、李金明主编。临床基因扩增检验技术北京:人民卫生出版社2002，P52~63 2E1873-97 Standard guide for detection of nucleic acid sequences by the polymerase chain reaction technique. NCCLs 1997 3Neumaier M, Braun A, Wagener C, et al. Fundamentals of quality assessment of molecular amplification methods in clinical diagnostics. Clin Chem 1998,44:12-26 4《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号) 5《临床基因扩增检验实验室工作规范》(卫检字[2002]8号) 6中华人民共和国医政司(叶应妩、王毓三、申子瑜主编)全国临床检验操作规程(第3版)南京:东南大学出版社2006 ，P927-931 7金华彰、马彦冰编著。2000版标准质量管理体系的建立与文件编制北京:中国计量出版社，2002，P177~202 8李金明、申子瑜正确认识临床实验室认可与提高检验质量之间的关系中华检验医学杂志2007，30(2):136~139 |
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