【原】怎样快速获得单克隆细胞？

2019年，超过15000篇文章使用了CRISPR/Cas9技术，CRISPR/Cas9可以说是本世纪生物技术领域最大的发现。这项技术已经彻底改变了生物学研究并得到广泛的应用，使研究疾病、研发药物变得更容易、更快，而其中，有4项基础应用格外引人注目！

01 靶向基因敲除

细胞内基因组DNA在被CRISPR/Cas9复合体(含Cas9和sgRNA)特异识别后，Cas9核酸内切酶特异切割目标基因组DNA双链，产生DSB损伤，从而诱发DNA损伤修复机制。

其中的NHEJ修复是一种易错修复，在修复过程中会随机引入或删除核苷酸对，导致目标基因内核苷酸对的删除或插入(indel)，从而形成移码突变，造成目标基因的突变、实现基因敲除。

而如果在编码基因的目标外显子的5'侧翼和3'侧翼分别设计一个sgRNA,则可以敲除目标基因内特定片段，实现基因敲除。

02 定点突变

Cas9切割目标基因DNA双链产生DSB损伤，然后诱发细胞启动同源重组修复（HDR)，使用带点突变的序列作为供体，通过同源重组的方式替代野生型位点，以造成特定位点的点突变.

03 编码基因的靶向基因敲入

通过用Cas9在待突变位点附近断裂双链DNA，此时，若提供同源修复模板供体，而此供体可以引入如保守区域替换片段或加入标签编码序列(如GFP、Flag、HA....)等，则研究者可实现在基因组特定位置的片段敲入。

04 CRISPR/Cas9基因编辑细胞

在CRISPR/Cas9基因编辑中，质粒转进细胞的效率和细胞单克隆生长的能力是影响基因编辑成功的主要因素