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近期，英国 Francis Crick研究所Charles Swanton与伦敦玛丽女王大学Trevor Graham合作在Nature Reviews Genetics杂志上发表了综述文章Resolving genetic heterogeneity in cancer，探讨了肿瘤的异质性以及进化模型，总结了二代测序在描绘肿瘤进化轨迹、辅助精准治疗等中的应用。现全文编译如下，以飨读者！ 摘 要 癌症在很大程度上与克隆的变异速率、适应速率和生长速率的进化规则一致。二代测序已经提供了大多数癌症的遗传变异全景图，并且癌症基因组学方法也提供癌症时空演化模式上新的见解。癌症的克隆进化与物种进化相反，因为肿瘤细胞群有巨大的规模、染色体的不稳定性及其表型可塑性的潜力。肿瘤克隆进化是研究癌症进展和治疗失败的有力武器，也可以用于预测个体肿瘤的行为并支持相关治疗策略。 前 言 肿瘤由细胞亚群（亚克隆）组成，可以依据影响其表型的多种变异进行分类，这些变异包括单核苷酸变异（SNV），小的插入或缺失（indels），体细胞拷贝数变异（CNA）和结构变异（SV）。遗传性瘤内异质性已在大多数癌症中得到证明，这些可作为研究克隆进化的基础。 肿瘤克隆进化的生物学机制与无性繁殖物种进化的生物学机制相似：复制、遗传变异、遗传漂变、选择和环境适应。 进化生物学中新达尔文合成论的核心是分子进化，也就是说，DNA序列水平的进化，这一点可以将孟德尔遗传与达尔文适应性联系起来。分子进化与癌症有关，而基因组测序能了解体细胞进化的时空模式和基因组变异积累。 反过来，分子进化的核心理论是群体遗传学，这是过去90年来用来描述进化的基本理论，该理论框架也可用来研究癌症的克隆进化。从根本上来说，癌症克隆进化动力学就是研究癌症亚群的时空相对频率变异。 尽管癌症进化的某些特殊性使其与经典物种进化有所区别，但是经典进化理论仍可以很容易地理解癌症的发展。 在过去的5年中，许多基于二代测序的研究已经描述了各种癌症的克隆进化模式，并显示出和临床的相关性。 本文就对肿瘤进化的相关理论模型进行综述，并列举正确解释基因组数据和推断进化动力学需要注意的事项。此外，作者讨论了肿瘤驱动因素之一的染色体不稳定性（CIN）与癌症进化尤其是转移的相关性，以及对癌症进行进化分类的临床价值。最后，作者讨论了克隆进化在治疗失败中的作用。 肿瘤进化模型 癌症会表现出惊人的复杂性并出现新的特征。然而，这种复杂性是由进化过程中相当简单的突变，遗传漂变和选择作用引起的，这些过程中涉及大量的互作因子（例如，单个病变组织内的数十亿个癌细胞和周围的肿瘤微环境）。肿瘤之所以出现不同的进化“模式”，这是由上述基本过程在不同环境中的不同因素组合共同作用的。换句话说，由于选择压力会随着时间变化而变化，因此肿瘤演化方式也会随之变化。本部分作者将讨论选择作用和不同的进化模式。 3.1 选择 选择是进化的关键动力，如果一个细胞世系比另一个更能适应环境，那么会产生更多存活的后代并产生适应性。通常来说，正选择是群体中某个谱系频率增加的动力，可驱动肿瘤进展。负选择，也称之为纯化选择，是种群中适应性降低的细胞消亡的进化动力，也会通过去除有效的新抗原而影响肿瘤的进化。 但是，选择并非任何时候都是奏效的。癌组织中突变和遗传漂变不断发生，其发生率取决于细胞分裂和种群动态，而选择则取决于环境。例如，如果一个种群中所有小生存率都一样，那么缺乏正向选择就意味着该种群的进化是中性的，只有突变和遗传漂变在起作用。因此，肿瘤系统发育树产生分枝并不总是意味着发生了克隆选择，因为分支也是突变过程的天然产物。 选择作用具有“修剪”肿瘤进化树分枝的效果。另外，突变率本身也可以被选择影响。较高的突变率可以快速实现遗传多样化，但也可能会增加扰乱癌症生长有害突变的速率。例如，过量的染色体不稳定（CIN）可能导致细胞自主性死亡。但是，适度的CIN可能在肿瘤进化上是有利的。 例如，在CIN的肿瘤细胞群进化过程中，复合物（APC / C；也称为环体）的亚基中的突变被选择会导致有丝分裂时间延长、染色体错配抑制并减少过量的CIN。 基于数学模型的研究表明，在不断增长的细胞群体中，突变体的表型会受到选择，一方面随机的正选择会增加突变的细胞自身的适应性，另一方面有害突变会对其他细胞种群产生负面适应性。有些模型还表明，突变体表型会提高癌发生的效率，选择会倾向于使癌症转移和发展所必须的突变获得变得更加容易。 3.2 分支进化 因为细胞分裂和突变会不断产生新的差异，所以进化往往会倾向于分支进化。癌症分支型进化尤其如此，因为癌症通常具有突变表型。 原则上来说，在任何给定的时间点，肿瘤细胞群会包含不同的细胞世系。这些不同世系的细胞新生率和死亡率的随机波动会导致遗传漂变，一个世系比另一个世系产生更多的存活后代的话会产生偶然性的扩张。 遗传漂变是产生中性进化的一种形式，因为所有细胞世系产生存活后代的机会都是对等的。但是，假设没有其他限制因子影响细胞生长，当某个癌症亚克隆的适应性提高时，会因为选择的存在而扩张，如某个癌症亚克隆的驱动基因产生突变。在同样的肿瘤内发现平行进化的过程中，选择作用也很明显，不同的癌细胞世系中相同的癌症驱动基因中突变后导致亚克隆的平行扩张。 3.3 线性进化 线性进化假定随着时间的推移，只有某一个细胞世系可以存活。但是，这并不意味着只会逐渐形成一个细胞世系。如果只有一个克隆能够存活到采样点，然后也被检测到，那么进化会呈现线性模式。但是，关于癌症线性进化的结论可能会受制于癌症样本数量和二代测序技术的分辨率。 3.4 中性进化 中性进化在细胞种群内存在无差异选择的情况下发生。在发生适应性突变之前，细胞种群会遵循中性进化模式。当发生突变时，克隆清除就会启动，该清除作用可能是完整的也可能是不完整的（就是突变的细胞可能部分或者全部消亡）。如果清除完成，并且种群中的所有细胞都进行了同样的适应性突变，则进化动力将又恢复为中性。 3.5 间断进化 间断进化假定适应性进化迅速大爆发，而不是连续的渐进性适应。如果适应性突变是基因组的大尺度变异（例如染色体的丢失、获得、易位或融合），则该适应性克隆被称为“有希望的怪胎”。 与小尺度的突变相比，适应性克隆的基因组发生了非常显著的变化，“有希望”是指突变具有较大可能的适应性。 间断平衡学说是Eldredge和Gould于1970年代初首次提出的，用来描述物种进化的一种模型，其适应性发生在一个空间上被孤立的小生态位中，直到新适应的个体迅速从原生态位中扩张出来并穿过更广泛的种群。 由于原来的生态位很小，逐渐适应的种群在扩张之前不太可能被采样，因此小生态位种群适应性的扩张会打破总体种群的进化动态。 平衡是指表面上的克隆分化较长时间停滞，在此期间，适应的克隆在所有种群中以较低（可能还无法检测到）的频率持续存在。 用基因组学推断进化模式 尽管适应性的结果体现在表型上，但是在其起源环境中测量肿瘤细胞表型是极具挑战的，取而代之的测量相关细胞基因表达之类的数据。这类数据能提供有用的信息，但是考虑到癌症转录组的复杂性和可塑性，以及肿瘤微环境中细胞对基因表达信号的贡献，它们往往很难用进化来解释。 这就是为什么到目前为止，基因组图谱（DNA水平）一直是研究癌症进化的首选工具的原因。但是，当作者尝试通过研究基因型来了解表型时，有几个主要问题需要注意，这些问题在分子进化领域已经存在了数十年。 其中最关键问题是，除了一些明显的例外（例如对某些治疗有耐药性突变），癌症的基因型-表型一一对应的图谱基本上是未知的。可想而知，确定肿瘤系统发育树和潜在的适应性性状直接的关系仍然十分困难。 4.1 混池/混合测序（Bulk Sequencing） 这里的混池/混合测序是相对于单细胞测序而言的。混合测序，即对包含许多个细胞的样品进行测序，这会对肿瘤进化的推论产生干扰和阻碍。 由于一般测序深度（100-1,000X）比样品中的细胞数（1000万至10亿个）小许多个数量级，因此混合测序只能测到给定癌症样本的细胞中大多数存在的突变。癌细胞种群每增加一倍，种群中出现的新突变的频率就会减半。 因此，7次加倍后，就无法通过100x测序检测到新的突变，而经过10次加倍后，就无法通过1000 X测序深度检测到新的突变。常规深度测序只能检测到有限的克隆（数百至数千个细胞），因此这是Bulk测序目前存在比较大的问题。 基质细胞的污染也会稀释癌症等位基因的频率。混合测序主要是测样品中细胞的最近共同祖先（most recent common ancester）。混合样品中的细胞越多，最近的共同祖先就越古老，进化树中的分支也越短（在多区域混合样品测序的情况下）。从数学上讲，这种现象源于合并理论。 因此，同一个肿瘤类型，不同大小的样本可以产生不同的肿瘤克隆结构特征。 4.2 测序试验的选择 肿瘤突变分为乘客突变（passenger mutation）和驱动突变（driver mutation）。 相对处于正选择之下的驱动突变而言，乘客突变相对丰富，在进化上是中性和非适应性的，这使得在驱动事件上“搭便车”的乘客突变提供区分不同功能克隆的遗传标记。 更具体地说，谱系特有的乘客突变的数量可以度量该克隆的分子年龄。 等位变异频率（VAF）决定了克隆的丰度，克隆之间共有的乘客突变比例反映了它们的祖先情况。有不同的测序策略供选择（高深度的靶向panel，中等深度外显子组或更低深度全基因组重测序）。高深度测序可以准确复原克隆频率，全基因组范围内检测乘客突变可以鉴定不同克隆。 此外，由于深度更高的测序为癌症的进化研究提供了更长的时间尺度，因此不同测序方案选择是在全基因组测序和深度靶向测序之间的一种权衡。 全基因组测序（深度较低）可以提供短时间和早期癌症的克隆结构和细节信息，而高深度靶向测序则提供了有限的克隆信息，但克隆发育时间范围更大。 在此，作者更推荐测序深度更高，测序范围更广的测序策略。 4.3 等位的拷贝数变异校正 癌症克隆进化动力学的研究从根本上来说是研究克隆在空间和时间上的相对频率。目前已经有许多生物信息学工具利用大量测序数据推断克隆频率，例如PyClone，SciClone和PhyloWGS。这些工具试图识别出所有具有相同频率的突变数据集，并将其分配给不同克隆。 这些工具对于利用混合测序的数据研究癌症的演化非常有用。但是，进行克隆鉴定需要许多先验推理步骤，每个步骤都有引入错误的风险，这些错误随后会通过分析加深。 结构变异（遗传物质的丢失、增加和重排）在癌症基因组中很常见，并且会混淆突变频率。因为结构变异通常会改变基因座的拷贝数，也会影响该基因座上任何SNV的相对频率。因此，为了将SNV准确分配给克隆，有必要校正CNA的影响。 从理论上讲，这很简单———任何单个突变的细胞丰度是其频率和拷贝数的乘积。但是，如果错误地推断了等位基因拷贝数，则该CNA中的SNV将被缩放到错误的频率中，可能会错误地定义为一个新克隆。 在肿瘤纯度为50％的肿瘤样本中，三分之一拷贝中SNV频率与四分之一拷贝中SNV频率之间的差异仅有约3％，中等深度测序很难检测到这种差异（≈100×测序深度）。此外，错误可能源于该基因座拷贝数变异的推断。 因此，等位基因拷贝数推断产生的错误（在给定位置存在多少个拷贝数变异）和将SNV分配给拷贝数（多少个等位基因拷贝有该突变）产生的错误叠加在一起，产生错误的克隆系统发育树，并输出一个错误的克隆结果和具有误导性的肿瘤克隆结构图片。 仅考虑位于二倍体区域的SNV并利用“遗传搭车”效应会对克隆鉴定有所帮助，但在高度非整倍体变异的基因组中，可能会存在舍弃大多数SNV后进行下游进化分析的风险，从而导致亚克隆信号的缺失。需要特别注意的是，克隆识别是根据克隆的大量“搭便车”突变进行的，而不是根据驱动突变进行的。作者仍然需要更高分辨率的数据（全基因组测序> 100 X深度）和改进的克隆分解方法，以便能够有效处理误差积累和定量的不确定性。 新兴的长读长和linked-read测序技术燃起了规避此类问题的希望，因为长读长本质上是相位突变，直接揭示它们的等位基因identity。 4.4 单细胞测序 单细胞测序能替代混合测序进行肿瘤进化研究。从理论上讲，对单个细胞进行测序可消除混合测序固有的时间偏倚，因为无论何时出现突变，被测序的细胞内所有遗传突变均可被检测到。 克隆鉴定也变得简单，不用考虑校正等位基因拷贝数。 然而，由于噪声水平和数据缺失，检测单细胞中SNV仍然具有挑战性。 合并多个细胞的信息可解决此问题，但是会丢失单细胞的分辨率。相比之下，CNA可以在单个细胞中被可靠地识别。但是由于背景拷贝数变异（CNA）率仍未得到很好的定义，因此从这些数据中得出关于肿瘤时间演化动力学的推论并不容易。 总而言之，单细胞测序可以获得可靠的CNA，因为对单个细胞进行测序意味着可以在选择发生之前分析一些新生的细胞，增加对背景CNA突变率的理解。 对样品组织较大的癌样品进行单细胞测序可能会对许多处于“进化死胡同”并且不会对未来疾病发展做出贡献的细胞进行测序。 只需对大量细胞进行测序就可以解决这个问题，而且还提供一种直接的方法来检测和鉴定CNAs上的是否存在纯化选择，这些是通过混合测序无法实现的。 作者预计，随着测序成本的持续下降，单细胞测序将成为未来研究肿瘤克隆进化的首选工具。 检测选择作用 克隆选择会驱动癌症的发展，因此，很自然地，人们对克隆的选择性优势的原因非常感兴趣。 但是，检测选择作用面临一些挑战。有两种广泛的检测选择的方法：基于克隆频率的方法；基于突变模式的方法。这两种方法是互补的，结合起来使用更搭。 5.1 利用克隆频率检测选择作用 广义上来说，基于频率的方法检测选择作用是指通过寻找比中性进化模式下预期的细胞世系丰度更高的世系。 具体是通过利用VAF（通常也称为点频率频谱）的分布来实现，利用VAF替代样本中细胞世系频率。这种方法的好处在于，在混合均匀的群体中，中性进化的VAF分布是大家都知道的。 中性进化时突变数m（f）是等位基因频率f的函数，遵循1 / f2分布。多区域采样也可以用来测量克隆频率；根据这些数据构建的系统进化树中，对祖先克隆的选择作用会导致其后代的数量不成比例。 除了以上的方法之外，还存在同时考虑来自多区域采样的VAF分布的方法。 克隆丰度的纵向采样提供了一种特别强大的检测选择作用的方法。相对于其他克隆而言，不成比例增长的克隆可能受到选择。 然而，由于肿瘤组织的可及性，对实体瘤的纵向组织收集和时间分析变得困难重重。随着测序技术的改进和成本的下降，作者预计对cfDNA的分析将有助于规避其中的一些挑战。 基于频率的方法检测非中性进化的微小偏差（例如，来自1 / f2分布的偏差）能力有限。弱选择（例如，约1％的相对选择性优势）作用只会导致克隆频率缓慢而轻微的变化，中等深度测序可能都无法检测到这些克隆。遭受弱选择的克隆可能永远都不会被检测到，特别是如果它们出现的时间太晚，可能需要比人类一生更长的时间才能成为优势克隆。 肿瘤的空间结构也会带来新的问题：有可能全部被选定的样品都是来自于同一个克隆，毕竟选择作用是肉眼看不到的。此外，基于频率的方法只能检测总体中正在进行的差异化的选择。一旦选定的克隆被接管并被固定，新的肿瘤细胞群就是同质的，此时，肿瘤内的进化恢复为中性进化。 在这种情况下，必须进行密集的纵向采样才能准确检测到选择作用。因此，从单个低测序深度样本中进行选择作用的推断有很大的风险。 5.2 利用突变pattern检测选择作用 选择作用检测的另一种方法是利用基因组中的突变负荷和突变类型，作者将它们统称为“突变pattern”法。这些方法基于这样一个事实：选择会导致某些突变的比例升高，从而增加携带该突变克隆的适应性，这个特征可以用来衡量细胞谱系分化程度。 确定肿瘤中癌症驱动突变的原理是确定癌症中发生突变的基因频率与背景期望值的比值。dN / dS（非同义突变（N突变）与同义突变（S突变）比值）是一种主流的基于测序检测选择作用的方法。 该方法的内在逻辑是非同义突变将倾向于经历过选择，而同义突变在进化上将是中性的。 因此，正选择将导致NS突变的比例升高（dN / dS> 1），而负选择将导致NS突变降低（dN / dS <1）。驱动基因应具有高的dN / dS值，目前已经有专门针对癌症数据的改良dN / dS计算方法。 为了使dN / dS方法有效，必须在受选择的基因或基因座中找到足够数量的突变，以使该比率在统计学上显着偏离1。因此，需要最小的突变负荷来计算该比值，该方法很难应用于基因突变太少的队列研究中。 重要的是，dN / dS方法能估计整个患者群体中平均的受选择强度，但是很难应用于个体肿瘤的进化动力中。少量经历正选择的患者不足以驱动整个队列的dN / dS值的变化。群体结构也以复杂的方式影响着dN / dS，并使解释选择作用变得困难。 最后，将基于频率的方法与基于突变pattern的方法相结合可以部分克服各自方法的局限性，从而提供更可靠的克隆选择估计。 5.3 随机性vs确定性 在癌症或者其他物种组成的小规模种群中，随机性可以左右遭受强烈选择的突变的进化关系，但是大群体中的大型克隆的进化不易受随机性的影响。 由随机进化转变为确定性进化的克隆大小与突变体的选择优势成反比。这种从随机性到确定性转变的进化规则暗示癌症的进化具有可预测性：小的、随机性进化的克隆进化模式不可预测，而大的克隆进化则具可预测性。 换句话说，作者能够准确地预测已经生长到足以被检测到的克隆的进化。 但是，准确预测特定的小的克隆的出现变得非常具挑战性。 肿瘤进化的染色体不稳定性（CIN） 6.1 CIN及克隆适应度 拷贝数变异对癌症基因组的影响比其他任何突变都要大，这为癌症进化提供潜在的适应性基础。拷贝数变异是CIN的结果。 在有丝分裂期间，染色体分离过程中持续不断的错配以及DNA复制和修复过程中的持续不断的错误会导致拷贝数的变异。最终结果是产生非整倍性变异，包括整条染色体非整倍性变异或者染色体某一部分的非整倍性变异。 单个染色体错配事件也会导致非整倍性变异以及相关克隆的扩张，因此非整倍性也可以独立于CIN而发生。这类肿瘤是同质性的非整倍体，而正遭受CIN的肿瘤是异源的或亚克隆性非整倍体。 此外，非整倍性变异也可能是由单个灾难性事件引起的，这些事件被称为一种复杂的染色体重排事件chromoplexy（如果影响多条染色体）或染色体碎裂（影响1-2条染色体），这类非整倍性变异与不同类型癌症的相关性越来越明显。 非整倍性变异可以同时改变许多基因的体细胞拷贝数，进而引起相关基因表达的差异。尽管背景改变率在整个染色体上都有差异，但它不能解释肿瘤中反复出现的染色体水平或染色体臂水平畸变，但是这可能通过选择作用来解释。 肿瘤抑制基因和癌基因的位置囊括了不同癌症中观察到的非整倍性变异模式，也展示出由CIN提供的适应性潜力。 在急性淋巴细胞白血病和肝癌的小鼠模型中，T细胞和肝细胞中诱导CIN导致肿瘤特异性的染色体拷贝变异，暗示选择性压力具有组织依赖性。 CIN还会导致通过手术进行根治性治疗或通过靶向治疗的癌症产生疾病逃逸（disease escape）。 在肺癌的KRAS模型中诱导CIN会导致癌症快速复发，复发的肿瘤表现出高水平的非整倍性变异，并且与原始的致癌因素刺激无关。 在慢性粒细胞白血病中，对靶向BCR-ABL的伊马替尼治疗产生抗药性的患者会发生额外的染色体级别的变异。 CIN的某些效应与基因特异性变异无关，这些变异包括增殖减少，蛋白毒性应激，代谢变化，应激反应上调和进一步的基因组不稳定。额外的基因组不稳定性具有深远的影响，因为非整倍体变异癌细胞会继续产生更多的遗传多样性。 非整倍性（或CIN）既可能有害又可能有利的事实凸显了选择作用的重要性。这一点在酵母中得到了很好的阐述，非整倍性变异的酵母在严酷的环境下具有适应性优势，作为“防御的首道进化线”。 但是在环境恢复正常后，隔代遗传后非整倍性变异却消失了。在对小鼠胚胎成纤维细胞中非整倍性致癌潜力的系统研究中，三体性在任何条件下均无法诱导转化。 与配对的整倍体细胞相比，三聚体的细胞生长较差，和适应性惩罚一致。但是，在长期生长过程中，三体细胞又获得了额外的非整倍体变异，导致适应性提升。 作者认为，低水平的非整倍性变异可能对肿瘤具有保护作用，但在某些生长条件下，非整倍性变异的基因组不稳定效应可促进肿瘤生长。 因此，稀有的促进生长的非整倍性变异的极少数量细胞会不断扩张并上升到克隆水平，而生长受抑制的非整倍性变异细胞被选择后消除。 与这一观点相一致的是，在环境压力（如缺氧和化疗）下，非整倍体变异的细胞的生长优于整倍体的细胞。添加单条染色体增加了细胞对环境压力的耐受性，但是并不针对特定的染色体，这表明特定基因的过表达并不是提升适应性的唯一因素。 6.2 CIN和癌症转移 癌细胞转移和扩散需要多种表型的细胞类型，CIN产生的核型和表型异质性又能为产生这些细胞类型创造条件。基于配对的原发肿瘤-转移肿瘤的比较研究表明，前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和结肠癌的转移性病灶中存在非整倍性变异的富集。 最近，利用配对的透明细胞肾细胞癌（ccRCC）原发性和转移性肿瘤解析其克隆结构，结果显示转移性克隆与非转移性克隆之间的关键区别是染色体非整倍性变异程度和染色体复杂性（chromosome complexity）。 此外，作者还观察到特定的体细胞CNA变异（9p的缺失和14q的缺失）在转移性克隆中高度富集，没有证据表明小尺度的突变比如SNV受到选择。 除了同时改变许多基因的表达外，促近癌细胞转移的染色体级别变异的潜在机制还包括通过细胞间连接蛋白的表达的改变来诱导间质转化，使用来源于染色体错配的细胞质DNA激活cGAS-STING通路、以及免疫逃逸。 6.3 CIN和临床预后 在许多回顾性研究中，CIN与不良临床预后的关联证明了CIN在癌症发展和进展中的作用。 最近，对早期非小细胞肺癌（NSCLC）克隆进化的前瞻性队列分析表明，CIN会增加肿瘤复发和死亡的风险，而与某些已知的预测标记无关。 与NSCLC相似的透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的前瞻性研究中，非整倍性变异的增加与较短的无进展生存期和总体生存率相关。 有趣的是，CIN水平与其对预后整体影响有关。在对超过2,000多个样本的泛癌研究中，只有中等水平的CIN（> 25％和<75％）与存活率降低相关，先前也有一致的研究表明过量的CIN水平可以改善预后。 这些结果与CIN适应性成本一致，过高的非整倍性变异水平使具有异质性的核型丧失选择性优势。 CIN还与化疗和肿瘤免疫治疗的耐药性相关。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，CIN会导致编码人白细胞抗原（HLA）的基因的亚克隆杂合性（LOH）丢失，并在肿瘤中发现杂合性丢失存在正选择。这篇文章还发现，人白细胞抗原LOH事件有利于亚克隆新抗原的积累并使克隆进一步进化。 在ccRCC中，作者观察到HLA LOH的比率在原发性肿瘤亚克隆中增加，在肿瘤转移病灶中受到选择，再次强调了免疫逃避在肿瘤转移中的作用。 进化模式和患者预后 在精准医疗的背景下，了解肿瘤的进化轨迹和进化潜力是否可以帮助预测患者的预后仍然是一个关键问题。 7.1 克隆多样性和临床预后 克隆多样性（中性和非中性）能使肿瘤从容面对适应治疗带来的选择压力，也有利于肿瘤适应肿瘤环境或远端转移性定植。 在一项Barrett食管（一种癌变前疾病）的前瞻性研究中，疾病发展为腺癌的进程与克隆多样性相关，而与其他遗传风险因素无关。 慢性淋巴细胞性白血病、头颈癌、卵巢癌和其他癌症类型中，亚克隆多样化与不良临床预后之间存在关联。CNA和驱动突变的亚克隆多样化与ccRCC不良的预后相关，与无进展和总体生存率降低独立相关。 在NSCLC中，体细胞CNA的多样性与复发和死亡的风险相关，体细胞SNV与复发和死亡风险无关。 在乳腺癌的患者中，肿瘤内HER2（也称为ERBB2）拷贝数的异质性与较短的生存期相关。 在多发性骨髓瘤中，中性进化与无进展生存期和总体生存率相关，并且与优势克隆的致癌驱动因子有关。 7.2 间断进化vs渐进进化和临床表型 越来越多的证据显示，有些肿瘤在短期内会获得多个和/或强的驱动突变（间断进化），而另一些研究则显示驱动突变获得是稳定的（渐进进化）。 间断进化的结果是快速的克隆清除并形成功能上均一的肿瘤组织。 在ccRCC中，这些肿瘤组织具有低驱动突变瘤内异质性和高水平的克隆非整倍性变异特征，这些非整倍性变异在肿瘤发展的早期就已被选择所固定。此类肿瘤的增殖速度更快，能迅速扩散到许多不同的位置。与克隆多样性和亚克隆非整倍性变异的肿瘤相比，此类克隆的肿瘤预后更差。 原发部位快速进化的肿瘤中，相同的优势克隆播种形成转移瘤，使未经治疗的患者产生有限的转移瘤内异质性。相比之下，具有亚克隆非整倍性变异的肿瘤以达尔文方式进化并逐渐积累驱动突变，肿瘤组织生长的速度较慢且持续时间较长。 在某些情况下，转移瘤是由多个克隆播种的，进而导致转移瘤内有较高的异质性（在未经治疗的患者中）。与这一发现一致的是，一项肿瘤转移形成的数学模型研究表明当原发性肿瘤生长缓慢时，观察到转移瘤内异质性的增加（原发性肿瘤中不同克隆播种到不同转移部位的结果）。 有趣的是，逐渐进化的肿瘤也与转移进展的一种称为寡转移（oligometastases）的特定模式有关。 寡转移仅局限于单个部位的少数病变，处于转移能力强和弱的中间状态（具有重要的临床意义）。不同肿瘤无性系转移效率降低可能原因是克隆干扰（原发性肿瘤部位的克隆间竞争）或克隆驱动力弱，此时亚克隆驱动事件发生为肿瘤转移提供了额外的可能性。 多数胰腺癌逐步获得驱动突变事件，呈现出渐进式的进化模式。然而，某些胰腺癌通过一次灾难性事件获得多个驱动突变事件，导致复杂的基因组重排，最终表现出间断的平衡。 肾癌中的观察一致的结果，这种进化轨迹导致转移瘤内较低的异质性，因为所有转移都是由原发性肿瘤中优势克隆播种的。 另一个例子是葡萄膜黑色素瘤，具有强侵袭性，会发生潜在的肝转移，特别是原发性肿瘤带有BAP1突变的患者中。 BAP1突变和染色体复杂性变异在肿瘤发生的早期短暂爆发，暗示癌症发展的最早阶段就已经获得了转移潜力。 在三阴性乳腺癌中也观察到类似的结果；在前列腺癌和结直肠癌中，染色体复杂变异和染色体碎裂会发生涡轮增压式进化。 最后，肿瘤进化过程中突变获得的时间顺序会影响骨髓增生性肿瘤，ccRCC，NSCLC和乳腺癌的临床表型和预后，这是进化受到限制的证据。 癌症中广泛的进化模式会导致各种临床的表型和不同预后。尤其是，基因组间断进化模式凸显了管理早期获得转移能力的癌症需要面临的挑战。 临床前模型表明在组织学检测到恶性肿瘤之前，肿瘤已经出现了转移性扩散。这些观察结果与癌症筛查方法相关。 由于侵入性克隆的出现与癌转移扩散之间的潜伏期很短，因此早期检测肿瘤的窗口期可能非常短暂。 肿瘤进化轨迹仍然存在许多问题，包括有利于渐进进化（逐渐积累驱动突变）或间断进化（基因组的大规模重排导致很快获得许多驱动突变）的环境条件，以及如何改变这些环境以获得好的治疗效果。 对治疗产生抗性的克隆起源 尽管在癌症的治疗方面作者已经取得了持续的进步，但转移性肿瘤仍基本上无法治愈。理解在选择的治疗压力下癌细胞的抗药性如何进化，可以为延迟或预防耐药性的出现提供新的策略。 8.1 对靶向治疗的耐受性 在血液瘤和实体恶性肿瘤中，通过靶向致癌驱动基因的治疗已给癌症治疗领域带来了显著的变化。 典型的例子包括慢性粒细胞白血病中的BCR-ABL易位，使用伊马替尼靶向治疗可使患者10年生存率达到85％左右。 但是，除了慢性粒细胞白血病以外，其他癌症靶向药物的疾病控制是相当短暂的。 实体瘤突变的复杂性可能是促成耐药性的因素，因为任何一个突变都可能成为治疗产生耐药性的pathway。较高的肿瘤突变负荷（TMB）与EGFR抑制剂治疗转移性非小细胞肺腺癌（NSCLC）（EGFR突变）的疗效缩短有关。虽然耐药性突变可能从头出现（de novo），但它们通常以次要克隆的形式存在。 但是，如前文所述，在预处理的样品中检测到次要克隆受限于采样宽度和测序深度。肿瘤生长的模型表明，转移性病变中可包含十个或更多个耐药亚克隆。尽管这些模型存在一定局限性，但这些预测与临床和基因组数据中的结果一致。 在一项最近发表的使用依鲁替尼治疗的慢性淋巴白血病患者的研究中，因BTK和/或PLCG2突变的产生耐药性，这些突变在产生临床进展前15个月就可以通过高灵敏度方法被检测到，其中一些患者正发展多重抗性突变。 在其他类型的肿瘤中也有多克隆治疗产生耐药性的研究，结果表明在治疗的选择压力下，克隆的平行扩张具有不同的耐药机制。抗药性克隆的早期评估还可以用于预测治疗疗效的长短，最近在转移性结直肠癌中使用频繁的时程液体活检和数学建模证明了这一点。 因此，一个全面的耐药性突变目录可以为适当的组合治疗策略提供参考，而动态监测新出现和正在治疗的变异则可以促进适应性治疗策略的落地。 这种想法已被用来指导结直肠癌中EGFR抑制剂治疗措施，也被用在血液中RAS耐药突变等位基因的蜡化和减弱的治疗中。 这些结果还突出了与耐药性突变相关的惩罚性适应问题：KRAS突变能在对EGFR抑制剂产生抗性的患者的cfDNA中检测到；但是，当治疗停止时，它们就无法检测到，表明他们需要持续治疗以维持其健康，而耐药性就是持续治疗的代价。 适应性成本越高，抗性克隆就越难出现，就像在PDX动物模型（对BRAF抑制剂产生抗性的具有BRAFV600E突变的黑色素瘤或NSCLC）中观察到的那样。 利用ERK（也被称为MAPK）抑制剂（作用在BRAF的下游）处理人源的异种移植瘤后，多个BRAF基因扩增的克隆被选择且得到繁殖。当BRAF，MEK（也称为MAPKK）和ERK抑制剂进行间歇性结合处理时，适应性劣势阻止了携带BRAF扩增的亚克隆的出现。 最后，克隆的复杂性可能会影响靶向药物自身。尽管骨干变异导致频繁的无性系繁殖，但是药物的靶标也可以存在于肿瘤的亚克隆中。 最近的一项临床试验中，对FGFR抑制剂有响应的病人具有FGFR扩增变异克隆，而无响应者则具有亚克隆扩增。 8.2 免疫检查点抑制（immune checkpoint inhibitors，CPIs）的耐受性 肿瘤治疗的另一个重要发展是免疫检查点阻断。CPIs疗效取决于免疫系统通过对肿瘤中新抗原的预先识别，这种新抗原是由肿瘤中积累的体细胞突变引起的。因此，CPIs疗法在具有丰富的体细胞突变（即高的肿瘤突变负荷）的肿瘤类型中最有效，充足的突变增加了向免疫系统提供有效新抗原的可能性。 最初，人们期望CPIs可以绕开靶向治疗所面临的克隆多样性难题。然而，克隆进化对免疫疗法的成功与失败有着深刻的影响。 亚克隆的新抗原不足以刺激产生肿瘤免疫反应，比如具有显著亚克隆突变负荷的黑色素瘤和NSCLC瘤中检查点阻断的敏感性降低。其他类型的肿瘤中也证实了这种情况的存在。 新抗原进化或免疫编辑是对CPIs产生耐受性的原因。有报道指出，在CPIs治疗的选择压力下，克隆和亚克隆中的新抗原均有丢失。染色体中相关区域的删除使该克隆中的新抗原丢失，而亚克隆中新抗原则通过某些亚克隆增生而丢失。非常重要的是，丢失的新抗原能产生肽段，会引起自体的T细胞扩增，表明它们产生了功能性免疫应答。 抗原呈递的失活是产生CPIs耐受性产生的另一个重要机制。失活的因素包括，B2M（编码主要组织相容性复合物I类抗原呈递的基本组分）以及编码干扰素受体相关的Janus激酶1（JAK1）或JAK2的基因中的点突变，缺失突变或者LOH。 像对靶向治疗有耐受性的驱动突变一样，这些突变在治疗中被选择并产生扩张。疫苗策略也容易产生耐药性进化。 在基于RNA的针对多种癌症突变的疫苗试验中，有一名患者中证实了新表位特异性杀伤，该患者最初有反应，但是由于缺乏β2-微球蛋白导致黑色素瘤细胞的生长而产生了耐药性。 免疫逃避的另一种机制是HLA突变或丢失的肿瘤细胞群被选择。在最近的一项KRAS突变结直肠患研究中，转移反应性的T细胞识别肿瘤所需的HLA基因有缺失。 结 语 对癌症进化动力学的理解可能会改善临床的预后，因为这将使精准地预测预后并应用“进化的视角”管理患者成为可能。基因组分析能对肿瘤进化动力和进化潜力进行定量分析。对迅速增长的癌症基因组数据库进行分析仍然具有巨大的价值，相互比较大量不同的癌症样本之间进化动力可以获得新的见解。 但是作者警告：这些结论严格受限于基于单活检的大批量测序数据集。随着测序成本的持续下降，更高深度的测序（例如超过100 X的重测序）将可以更准确地鉴定肿瘤克隆，降低从这些数据中得出的错误结论的概率，并可以解析较小数量的克隆。 单细胞测序技术可以避免混合测序数据的复杂性，而这一逐渐成熟的技术有望同时测定单个细胞中的基因型和表型，并对其原位微环境进行鉴定。 癌症样本可获得性是研究癌症进化动力的瓶颈。作者希望诸如TRACERx153和PEACE154研究的举措能变得更加的普遍，这些研究能够为肿瘤样本的采集提供基础设施。即使在单个时间点，这些研究也比单肿瘤活检样本具有更好的代表性，单肿瘤活检样本不足以代表肿瘤的全部，存在克隆被错误鉴定的风险。 液体活检样品的定量基因组分析（分析外周血样品中的肿瘤DNA）可能会克服这个问题，并为微创纵向疾病监测和对疾病进程和治疗响应的预测提供一条可行的途径。总而言之，基因组进化为揭示癌症克隆动态并影响患者预后提供了一个不断改进的视角。 |
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