【原】QPCR步骤(1)

QPCR（枪头和离心管均无RNA酶)

提取细胞RNA

1. 细胞长满80%，弃培养基，冰PBS洗涤细胞2次空干（用枪吸尽PBS)

2. 加1ml冰TRizoL（大皿1.5ml 中皿1ml 六孔板500ul）,吹打使细胞完全脱落，

吸入1.5ml  EP管(无酶)

3. 加氯仿200ul,漩涡混匀器振荡15秒，室温静置5分钟
4.  4℃  12000rpm  5分钟

5. 吸取上层水相（勿吸入中间层）0.5-0.7ml移至另一1.5ml离心管中，加异丙醇0.5-0.7ml（1:1加入）
6. 充分混匀，冰盒上静置10分钟， 4℃  12000rpm  30分钟

7. 弃上清,加75%冰乙醇（DEPC水）1ml, 颠倒混匀数次

8.  4℃  12000rpm  5分钟

9. 弃上清, 吸干, 加DEPC处理去离子水10-20ul （视沉淀大小而定)

10. 测浓度（取5ul作RNA电泳，5ul作RNA定量，余-80℃冰箱保存）

RNA鉴定：在紫外分光光度仪上测定RNA OD260/OD280均在1.8～2.0之间，表明抽提RNA纯度良好。

反转录反应：

1.去除基因组DNA：(0047A)

按下列组成配制反应混合液（冰上进行）：

试剂                加入量

gDNA Eraser              1μl 5×gDNA Eraser Buffer          2μl 总RNA                ≤1μg RNase Free 水            补足至10μl

 →离心→PCR仪（42℃  2min    4℃ hold）

2.反转录反应：(037)

按下列组成配制反转录反应液（冰上进行）：

试剂                      加入量

PrimeScript RT Enzyme Mix I            1μl 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）       4μl RT Primer Mix                     1μl RNase Free 水                     4μl

  →离心→PCR仪（42℃ 15min

      85℃  5s      4℃  hold

  得到的cDNA于-20℃保存

PCR反应：

采用Real-time PCR技术分别检测各基因表达丰度。所有操作均在冰上完成，以β-actin为内参基因，引物均由上海生工设计并合成。每组设置3个复孔，不同标本的相对表达定量（RQ，Relative Quantity）值RQ=2^-△CT。△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值。详细步骤如下：

按下列组成配制PCR反应液：

试剂                              加入量

TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）  5μl ROX Reference Dye II（50×）                 0.2μl PCR Forward Primer（10 μM）                0.4μl  PCR Reverse Primer（10 μM）                0.4μl DNA 模板                            1μl RNase Free 水                           3μl

 使用ABI 7500 Real-Time PCR仪按以下条件进行PCR反应：

      95℃ 30sec      预变性         1cycle     95℃ 5sec       60℃ 34sec      PCR反应     40cycles