为进一步提高《微生物组实验手册》稿件质量,本项目新增大众评审环节。文章在通过同行评审后,采用公众号推送方式分享全文,任何人均可在线提交修改意见。公众号格式显示略有问题,建议电脑端点击文末阅读原文下载PDF审稿。在线文档(https:///l/cL8RRqHIL)大众评审页面登记姓名、单位和行号索引的修改建议。修改意见的征集截止时间为推文发布后的72小时,文章将会结合有建设性的修改意见进一步修改后获得DOI在线发表,同时根据贡献程度列为审稿人或致谢。感谢广大同行提出宝贵意见。 枫香-真菌互作培养体系构建 Method for Constructing Liquidambar Styraciflua-Root Fungus Interaction System 王玉宸1, 2,彭龙1, 2,潘雪玉3,袁志林1, 2 * 1林木遗传育种国家重点实验室,中国林业科学研究院,北京;2中国林业科学研究院亚热带林业研究所,杭州;3中国林业科学研究院热带林业研究所,广州 *通讯作者邮箱:yuanzl@caf.ac.cn 摘要:林木可与真菌形成多种不同类型的关系以适应复杂的生存环境。作为林木-真菌互作研究的常见树种之一,北美枫香 (Liquidambar styraciflua) 是一种优良的抗逆树种选育材料,具有耐干旱、耐瘠薄、萌芽能力强、生长速度快等特点,通过播种繁殖易获得实生苗,经消毒处理后可得到无菌苗用于枫香-真菌互作培养体系构建。此外,北美枫香是优良的彩叶树种,叶入秋变红,是极具生态研究价值及观赏经济价值的造林绿化树种。为了探究枫香-真菌的互作机制及促进枫香适应环境胁迫的效应,需要建立标准的实验室体系互作研究方法。本文介绍了枫香-真菌互作培养体系的构建方法,包括育苗体系和接种方法等。 关键词:枫香,真菌,互作体系 材料与试剂 1.泥炭土 2.珍珠岩 3.蛭石 4.有机肥 5.ddH2O 6.超纯水 7.WPM粉末 (EKEAR) 8.改良MS培养基 (见溶液配方) 9.20× 大量元素母液 (见溶液配方) 10.100× 微量元素母液 (见溶液配方) 11.100× 铁盐母液 (见溶液配方) 12.100× 有机化合物母液 (见溶液配方) 13.IBA母液 (见溶液配方) 14.0.85%生理盐水 (见溶液配方) 15.0.1%升汞 (见溶液配方) 16.PDA培养基 (见溶液配方) 17.WPM培养基 (见溶液配方) 仪器设备 1.接种针 2.毛刷 3.纱布 4.剪刀 5.镊子 6.滤纸 7.漏斗 8.锥形瓶 9.封口膜 10.移液枪 11.血球计数板 12.打孔器 (直径7 mm) 13.大试管 (38 mm × 250 mm) 14.大培养皿 (直径15 cm) 15.光学显微镜 (Carl Zeiss, model: Axio Scope A1) 16.光照培养箱 (宁波扬辉,model: RDN-1500B) 17.PhytatrayTMⅡ培养容器 (sigma, catalog number: P5929) 18.立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安,model: LDZF-50KB-II) 实验步骤 1.真菌接种剂的准备 1.1菌饼接种剂准备 1)PDA培养基灭菌后取出,室温下放置,待培养基温度约45 °C后,倒入一次性塑料培养皿中,待培养基凝固后,进行接种处理。 2)从纯培养真菌平板菌落边缘用接种针挑取菌块,转移至PDA固体培养基上26 °C黑暗条件下培养。 3)待培养7 d后,自菌落边缘使用打孔器 (直径7 mm) 取菌饼作接种剂。 1.2孢子悬浮液接种剂准备 1)PDA培养基灭菌后取出,室温下放置,待培养基温度约45 °C后,倒入一次性塑料培养皿中,待培养基凝固后,进行接种处理 2)从纯培养真菌平板菌落边缘用接种针挑取菌块,转移至PDA固体培养基上26 °C黑暗条件下培养14 d。 3)制备终浓度为1×106 ml-1的孢子悬浮液。制备方法如下:取上一步骤中培养14 d的真菌,在其表面倒一层无菌生理盐水 (0.85% NaCl溶液) ,用无菌毛刷轻轻刮取菌丝。以四层无菌纱布过滤并收集滤液;取滤液50 ml,沿着盖玻片边缘滴入血球计数板计数室,使用光学显微镜进行计数;用生理盐水稀释至浓度为1×106 ml-1的孢子悬浮液作接种剂。 2.无菌北美枫香幼苗的培育 2.1枫香果实成熟期为10-11月份,果穗由绿色转为黄绿色,果实采集后阴干4-7天,然后暴晒数日,用棍打果实即可获得枫香种子 (种子在0-5 °C条件下可贮存5年左右,在-18 °C时贮存时间超过5年) 。将枫香种子播种育苗床。土壤基质及其配比:泥炭土:珍珠岩:蛭石:有机肥=1:2:2:2 (121 °C高压灭菌30 min) ,放置于光照培养箱,保持85%相对湿度,光照条件为14 h光照/10 h黑暗,25 °C恒温培养。 2.221天后,当种子萌发并长成株高3-4 cm的幼苗时 (如图1所示) ,从土壤基质中取出。 图1. 北美枫香实生幼苗培育。图为在育苗床中播种繁殖的枫香实生幼苗,实生幼苗培养条件为:25 °C恒温;85%相对湿度;14 h光照/10 h黑暗。 2.3在超净工作台剪去幼苗根部,将剩余地上部分放入0.1%升汞中进行表面消毒约12 min,再用ddH2O清洗4-5次去除表面残留升汞。 2.4林木专用生根培养基——WPM培养基 (Woody Plant Medium) 灭菌后取出,室温下放置,待培养基温度约45 °C后,在超净工作台中倒入无菌大试管 (25 ×240 mm) 中,待培养基凝固后,将表面消毒后的幼苗插入培养基 (如图2所示) 。 图2. 枫香幼苗生根培养示意图。图为在装有WPM培养基的无菌试管中进行幼苗生根培养,光照培养箱内生根培养条件为25 °C恒温;14 h光照/10 h黑暗。 2.5将培养有枫香实生幼苗的大试管转移到光照培养箱中,25 °C恒温培养,光照条件14 h光照/10 h黑暗。待实生幼苗重新生根,苗高达到5-6 cm后,可将幼苗取出进行继代繁殖。将每一株幼苗的幼茎剪断,再次插入新的WPM培养基中进行扩繁,转移到光照培养箱中并保持同样的温度和光照条件进行继代繁殖。 2.6选取根系大小、发达程度和株高较一致 (5-6 cm) 的无菌幼苗,进行共培养。 3.实验室体系:枫香无菌幼苗-根系真菌互作体系构建 3.1菌饼接种互作体系构建 1)超净工作台紫外消毒后,无菌PhytatrayTMⅡ培养容器 (长宽高:11.4 cm × 8.6 cm × 10.2 cm) 中倒入70 ml改良MS培养基。 2)将步骤2挑选的根系和株高较为均一的枫香无菌幼苗用镊子将轻轻取出,放入装有ddH2O的玻璃大培养皿中,洗除幼苗根部的培养基残留,并用无菌滤纸吸干表面水份后,转接至装有改良MS培养基的PhytatrayTMⅡ无菌培养容器内。 3)分为对照组和处理组,每组设置至少3个重复,每个重复包含10株无菌苗 (如图3所示) 。将步骤1.1中打孔获得的菌饼随机挑取5个均匀转接至根系周围,对照组接种灭菌后的菌饼,用封口膜进行密封,防止污染。而后,转移至光照培养箱中以相同条件继续培养,根据自身实验要求设计共培养时间,然后取样进行生理指标的测定。 3.2孢子悬浮液接种互作体系构建 1)超净工作台紫外消毒后,无菌PhytatrayTMⅡ培养容器(长宽高:11.4 cm × 8.6 cm × 10.2 cm) 中倒入70 ml改良MS培养基。 2)将步骤2挑选的根系和株高较为均一的枫香无菌幼苗用镊子将轻轻取出,放入装有ddH2O的玻璃大培养皿中,洗除幼苗根部的培养基残留,并用无菌滤纸吸干表面水份后,转接至装有改良MS培养基的PhytatrayTMⅡ无菌培养容器内。 3)分为对照组和处理组,每组设置至少3个重复,每个重复包含10株无菌苗 (如图3所示) 。将步骤1.2中稀释获得的孢子悬浮液用移液枪吸取1 ml接种至根系周围,对照组加入0.85%无菌生理盐水1 ml。而后,转移至光照培养箱中以相同条件继续培养,根据自身实验要求设计共培养时间,然后取样进行生理指标的测定。
图3. 枫香-真菌共培养体系示意图。图为在装有改良MS培养基的PhytatrayTMⅡ无菌培养容器中进行枫香-真菌共培养实验a:接种无菌PDA琼脂块作空白对照组;b:接种长满菌丝的菌块作实验处理组 溶液配方 1.PDA培养基 马铃薯 200 g (去皮煮熟后过滤取汁液) 葡萄糖 20 g 琼脂 15 g 加超纯水至1 L,调pH至7.0,121 °C高温高压灭菌15 min 2.WPM培养基 (Woody Plant Medium) WPM粉末 2.78 g 蔗糖 20 g 琼脂粉 7 g IBA母液 600 μl 加超纯水至1 L,调pH至5.8,121 °C高温高压灭菌15 min 3.改良MS培养基 20× 大量元素母液 25 ml 100× 微量元素 10 ml 100× 铁盐母液 10 ml 100× 有机化合物 10 ml 蔗糖 2 g 琼脂粉 7 g 加超纯水至1 L,调pH至5.8 ,121 °C高温高压灭菌25 min 4.20× 大量元素母液 NH4NO3 33 g KNO3 38 g CaCl2·2H2O 8.8 g MgSO4·7H2O 7.4 g KH2PO4 3.4 g 加超纯水至1 L 5. 100× 微量元素母液 KI 0.083 g H3BO3 0.62 g MnSO4·4H2O 1.69 g ZnSO4·7H2O 0.86 g NaMoO4·2H2O 0.0025 g CuSO4·5H2O 0.0025 g CoCl2·6H2O 0.0025 g 加超纯水至1 L 6.100× 铁盐母液 FeSO4·7H2O 2.78 g Na2EDTA·2H2O 3.73 g 加超纯水至1 L 7.100× 有机化合物母液 肌醇 10 g IVB 烟酸 0.05 g 盐酸硫胺素 0.01 g 盐酸吡哚醇 0.05 g 甘氨酸 0.2 g 加超纯水至1 L 8.IBA母液 IBA粉末 40 mg 溶于少量无水乙醇,吹打混匀 加60 °C超纯水至80 ml 9.0.1%升汞 升汞 1 g 溶于少量无水乙醇,吹打混匀 加超纯水至1 L 10.0.85%生理盐水 NaCl 8.5 g 加超纯水至1 L,121 °C高温高压灭菌15 min 致谢 本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金青年项目 (31901290) 的经费支持。 参考文献 1.秦媛. (2017) . 盐碱地植物共生微生物资源及功能初步研究. (Master's thesis,中国林业科学研究院) . 2.潘雪玉. (2018) . 沿海防护林树种促生、耐盐根系真菌筛选及机制初探. (Master's thesis,中国林业科学研究院) . |
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