【原】科研 | Environ. Pollut.：海水鱼类（黄鳍鲷）肠道微生物群在汞生物转化中的作用

编译：微科盟R.A，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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导读

无机汞（IHg）和有机汞（MeHg）均可通过甲基化或去甲基化相互转化，从而导致鱼类中Hg的形态和分布发生变化。但是，鱼类中汞的生物转化尚不完全清楚，该过程中的关键因素尚不清楚。本研究调查了海水鱼类（黄鳍鲷）体内Hg转化，并探讨了肠道菌群在Hg生物转化中的作用。本研究证明：在饮食中摄入IHg或MeHg时，鱼肠中分别发生Hg甲基化或去甲基化；观察到去甲基化要快于甲基化，这表明去甲基化可以显著影响鱼类中的汞形态。这项研究推测肠道菌群在汞生物转化中起主要作用，从而显著影响鱼类体内汞的总体积累和分布。在IHg或MeHg处理下，分别增加了Hg甲基化或去甲基化菌的丰度。此外，通过暴露于汞，鱼肠道菌群的组成也发生了改变。这项研究强调了肠道菌群在鱼类体内汞生物转化中的重要性，并推断调节肠道微生物组可能是减少鱼类中汞污染的潜在解决方案。

论文ID

原名：The role of intestinal microbiota of the marine fish (Acanthopagrus latus) in mercury biotransformation

译名：海水鱼类（黄鳍鲷）肠道微生物群在汞生物转化中的作用

期刊：Environmental Pollution 

IF：6.792

发表时间：2021.2.16

通讯作者：Xun Wang (王珣)

通讯作者单位：华南农业大学海洋学院，广东省与香港地区海洋生物资源保护与开发联合实验室

实验设计

结果

1 鱼类中无机Hg（II）和MeHg的积累

在不同的汞处理浓度下（对照，低IHg，高IHg，低MeHg和高MeHg）暴露30天，如图1和图2所示。在暴露期间，对照组所有鱼组织的IHg和MeHg浓度均未观察到显著变化（p> 0.05），这表明商业鱼类食品和海水足够”清洁”且不会影响鱼类的水平和形态鱼中的汞。在暴露期间，暴露组鱼组织中IHg和MeHg的浓度持续且显著增加（p <0.05）。对于高暴露于IHg的鱼，肝脏处的IHg浓度显著增加（与开始的第一天相比，下同），在肝脏处为（115×，下同），在肠壁处（450×），肠内含量（410×）和肌肉（16×）显著增加。实验结束。对于高暴露于MeHg的鱼，到暴露结束时，肝脏（11×），肠壁（15×），肠内容物（19×）和肌肉（14×）中的MeHg浓度也显著增加。

 

图1.在暴露30 d的不同Hg处理下，黄鳍鲷在肝脏（A），肠壁（B），肠内含量（C）和肌肉（D）中的IHg浓度。低无机Hg（II）IHg = 2.0 μgg^-1，高无机Hg（II）IHg = 10.0 μgg^-1，低MeHg MeHg = 0.2 μgg^-1，高MeHg MeHg = 1.0 μgg^-1。数据是平均值±SD（n = 3）。同一处理中的不同字母表示采样点之间的显著差异（p <0.05）。

 

图2.在暴露30 d的不同Hg处理下，黄鳍鲷（黄鳍鲷）在肝脏（A），肠壁（B），肠内含量（C）和肌肉（D）中的MeHg浓度。低无机Hg（II）IHg = 2.0 μgg-1，高Hg（II）IHg = 10.0 μgg-1无机，低MeHg MeHg = 0.2 μgg-1，高MeHg MeHg = 1.0 μgg-1。数据是平均值±SD（n = 3）。同一处理中的不同字母表示采样点之间的显著差异（p <0.05）。

 

但是，IHg和MeHg之间的累积效率差异很大。整条鱼的净Hg累积率计算为净增加的全身Hg浓度（每个组织中Hg浓度相对于新鲜重量的加权平均值）除以总摄入Hg浓度（食物Hg浓度×摄食率×暴露量）。低和高浓度IHg处理的净IHg累积率分别为5.23％和5.39％，而低和高浓度MeHg处理的净MeHg累积率分别为71％和80％，表明与甲基汞MeHg比，IHg很难被吸收鱼类所积累。这与以前的研究结果相一致，并且可能主要归因于饮食摄入量和IHg的清除速度比MeHg更快。此外，鱼类组织中IHg和MeHg的分布不同。对于暴露于IHg的鱼，暴露后IHg的浓度顺序是：肌肉<肝<肠壁的，而暴露于MeHg的鱼中不同组织之间的MeHg浓度具有可比性（表S2）。肠道中高的Hg积累是合理的，因为它是暴露于摄入的Hg中最直接的位置。采样时，肠腔中残留的肠内容物也是不可避免的，这也可能导致肠组织的高Hg水平。肝脏对于汞的积累很重要，并且是汞分布中的”转移点”，因此它可以比其他组织积累更高水平的Hg。与IHg相比，MeHg进入肌肉的转移更加稳定，而MeHg从肌肉中的清除则要慢得多，从而导致MeHg在肌肉中的有效积累量更高。

 

2 汞的生物转化及相关的肠道微生物

值得注意的是，从实验的开始到结束，暴露于IHg的鱼的组织中的MeHg浓度也显著增加（p <0.05）（图2）。在高IHg处理中，肝脏中的MeHg浓度（从44±6.8增至57±3.4 ngg^-1 FW），肠壁（从51±2.8增至95±17 ngg^-1 FW），肠道含量（28±6.3到65±14 ngg^-1 FW）和肌肉（从41±5.2到81±5.2 ngg^-1 FW）在30 d暴露期间均有所变化。从总体上看，在低和高IHg处理中，从实验开始到结束时MeHg水平分别增加了28％和96％（图S1B）。考虑到没有其他MeHg来源，暴露于IHg的鱼体内会发生Hg甲基化。体内Hg甲基化率可以通过甲基化分数（Fm，％）来评估，确定为从总摄入IHg（食物IHg浓度）得出的整条鱼中新积累的MeHg的比例×进食速度×接触时间。低和高IHg处理的计算Fm分别为0.82％和0.61％，这意味着在30天暴露期间，仅0.61-0.82％的摄入IHg转化为MeHg并积累在鱼体内。这些结果与罗非鱼的观察结果类似（尼罗罗非鱼——Oreochromisniloticus），在90天内的实验中为0.67-1.60％），并表明体内汞甲基化是鱼体内极其缓慢的过程。在我们的实验期内（30 d），如此低的汞甲基化率对鱼类总汞形态的贡献有限。然而，在自然长期条件下，体内甲基化对鱼类中MeHg生物积累的影响不容忽视，尤其是对于那些以总Hg和IHg％高的猎物（例如头足类，双壳类）为食的食肉性鱼类。

另一方面，在暴露期间，暴露于MeHg的鱼的组织中的IHg浓度也显示显著增加（p <0.05）（图1）。对于高水平的MeHg处理，肝脏中的IHg水平（从6.3±4.8到29±8.0 ngg^-1 FW），肠壁（从6.1±6.5到36±5.2 ngg^-1 FW），肠内容物（到实验结束时，从13±4.9到40±17 ngg^-1 FW）和肌肉（从9.0±3.6到18±8.0 ngg^-1 FW）也有所变化。在低和高MeHg处理中，全身IHg水平分别增加了1.6倍和2.2倍（图S1A），有力地暗示了鱼体内MeHg脱甲基的发生。同样，体内脱甲基率可以用脱甲基分数（FD，％）表示，脱甲基分数是根据总摄入MeHg得出的全鱼中新积累的IHg的比例（食物MeHg浓度×喂食速度×暴露时间）。低和高MeHg处理的计算出的FD分别为3.1％和1.6％，表明在30天暴露期间，摄入的MeHg的1.6–3.1％被去甲基化为IHg并积累在鱼体内。比较FD与Fm值（0.61-0.82％），在鱼体内更容易发生去甲基化，并且在影响鱼的汞形成中可能起更重要的作用，这与先前的报道一致。鱼体内的甲基化率高于甲基化率，这似乎与“常识”相矛盾，“常识”认为，甲基汞比鱼类汞更容易在鱼类中积累，并且更容易在食物链中转移。这可能归因于以下原因。首先，在我们的研究中甲基化和脱甲基化率均较低，这表明摄入的汞的有限比例（<4％）可以在实验期内（30 d）转化。因此，鱼类中汞的积累更多地取决于食物中的汞含量和形态。其次，MeHg具有比IHg高得多的同化效率，但清除率却低得多，这使其更易于从食物中吸收并保留在鱼体内。因此，MeHg通常被认为是鱼类中最主要的Hg物种，并且容易在食物链中被生物放大。有趣的是，食物中的汞含量较高时，甲基化和脱甲基化率均下降，这表明食物中汞的浓度可能会影响汞的生物转化。这是合理的，因为汞的生物转化可能是酶介导的过程，如果摄入的汞达到一定的高水平，酶将“饱和”；另一方面，应该注意的是，Fm仅增加了四倍（从0.82％降至0.61％），而FD却减少了一半（从3.1％至1.6％）。这意味着脱甲基剂比甲基化菌对食物中汞含量的变化更“敏感”。因此，甲基化菌/去甲基化菌的活性与食物中汞浓度之间的关系在未来值得关注。

肠道微生物组在鱼类的汞生物转化中起主要作用，原因如下：首先，与其他组织相比，在实验结束时，肠道中暴露于MeHg或IHg的鱼分别具有最高的IHg或MeHg水平（表S2），这表明肠道可能是肠道产生IHg或MeHg的主要反应池。其次，暴露于IHg或MeHg的鱼肠中hgcA或merA基因的丰度分别显著增加（p <0.05），而对照组则无显著变化（p> 0.05）（图。3）。在暴露结束时，低和高IHg处理的hgcA基因拷贝数分别比对照组高13.5和27倍，而低和高MeHg处理的merA基因拷贝数分别为2.1和3.6。分别比对照组高1倍（表2）。生物甲基化过程主要是由具有两个基因簇hgcAB的一组厌氧微生物进行的，其中hgcA编码为关键酶（HgcA），催化甲基转移到Hg（II）（Hg的中心步骤甲基化）。mer操纵子是细菌中分布最广泛的Hg排毒系统，merA在MeHg化合物的去甲基化和挥发中起着核心作用。因此，暴露于IHg或MeHg的鱼的肠道中hgcA或merA的丰度升高表明，在富集的IHg或MeHg条件下，Hg甲基化菌或去甲基化菌分别被“激活”。此外，观察到hgcA基因拷贝数与肠道内容物中MeHg浓度之间（R2 = 0.586，p <0.01），以及merA基因拷贝数与肠道内容物中IHg浓度之间（R2 = 0.287，p <0.01）存在显著正相关（图4）。这强烈表明肠道微生物（Hg甲基化或去甲基化）导致鱼肠腔中Hg的生物转化，而新产生的MeHg或IHg可能导致肠道中MeHg或IHg浓度显著增加（p <0.05）内容（图1，图2C）。陆克文等（1980年）还观察到淡水鱼肠中汞的甲基化过程，甲基化率经计算为0.005-0.4％d^-1，与我们的估计值（0.02-0.03％d^-1，经计算为是甲基化部分除以暴露时间）。在微观研究中，根特斯从鱼的肠内成分中鉴定出甲基化细菌，但是不能区分鱼中新积累的甲基汞是来自肠道甲基化还是营养转移。Pan-Hou和Imura观察到从黄鳍金枪鱼的肠道中分离出的一些特定细菌培养物中的MeHg明显降低，但无法描述它们在基因表达上的相似性。在本研究中，我们观察到汞生物转化与肠道菌群之间的直接关联，并证明汞甲基化或去甲基化主要是由具有hgcAB基因或mer operon的肠道细菌的特定群体进行的。

 

图3.在暴露30d期间，在不同的汞处理下，黄鳍鲷肠道内的hgcA和merA基因拷贝数（复制g^-1新鲜体重）。低无机Hg（II）IHg = 2.0 μgg^-1，高无机Hg（II）IHg = 10.0 μgg^-1，低MeHg MeHg = 0.2 μgg^-1，高MeHg MeHg = 1.0 μgg^-1。数据是平均值±SD（n = 3）。

 

表2.在不同的汞处理下，黄鳍鲷的肠道含量中的hgcA和merA基因拷贝数。数据是平均值±SD（n = 3）。同一列中的不同字母表示在p <0.05的水平上采样点之间存在显著差异。低和高无机Hg（II）IHg分别是2.0和10.0 μgg^-1的加标食物;低和高MeHg分别是0.2和1.0 μgg^-1 MeHg掺入的食物。

 

图4.在IHg处理中鱼的肠内hgcA基因拷贝数与MeHg浓度之间的相关性（A）在MeHg处理中的鱼的肠内merA基因拷贝数与IHg浓度之间的相关性（B）。

 

MeHg是鱼类中Hg的主要形式，会对人体神经系统造成更大的损害。长期以来，人们一直认为降低MeHg的生物利用度是限制鱼类吸收MeHg的主要途径。然而，我们的研究发现肠道微生物组在汞生物转化中起主要作用，因此影响了鱼类中汞的形态。这为制定涉及鱼类中甲基汞控制的措施提供了另一个视角。首先，肠道微生物组中甲基化和脱甲基化菌的丰度可以作为鱼类中汞甲基化或脱甲基化能力的“指标”。如果鱼的脱甲基剂含量相对较高，则鱼肠中的Hg脱甲基会更容易发生。该指标可帮助评估不同鱼类（或种群）之间甲基汞的积累潜力，从而选择低甲基汞积累的鱼类。其次，这可能是通过肠道微生物调节降低鱼类中MeHg积累的可能途径。如果去甲基化菌（而不是甲基化菌）成为肠道微生物组中的主要种群，则在肠道中会促进MeHg的去甲基化，从而导致鱼类减少MeHg的积累。因此，可能有益于汞脱甲基剂生长的因素（例如温度，pH，益生菌，益生元）值得进一步研究。但是，应该指出的是，肠道微生物组是一个相当复杂的“系统”，任何突然的变化都可能对鱼类健康造成不利影响。因此，对肠道微生物组进行“适度调节”可能更适合确保有益肠微生物的活动不受影响。

 

3 肠道微生物群落组成

我们获得了包含来自421866个reads的1470个OTU的最终数据集，用于下游分析。根据α多样性矩阵（表S3），在IHg和MeHg处理下，微生物丰度（Chao1和ACE指数）均显著降低（p <0.05），而在不同处理之间微生物多样性（Shannon，Simpson和PD指数）没有显著变化，说明汞暴露会抑制肠道菌群的生长。如未加权UniFrac距离的PCoA分子所示（图5），三种处理之间的微生物群落组成存在显著差异（基于未加权UniFrac距离的ANOSIM，R = 0.41，p = 0.001）。对照和高MeHg处理相对相似（R = 0.29，p = 0.012），并且两种处理均与高IHg处理显示出显著差异（对照：R = 0.38，p = 0.001;高MeHg：R = 0.59，p =0.001）。为了探究了微生物群落差异，确定了门（相对丰度> 1％）和属（至少一个样品> 5％）进行多重比较（图6）。在18个选定属中的4个中，两个处理之间存在显著差异（p <0.05）。

 

图5.对照（灰色），高IHg（蓝色）和高 MeHg（红色）处理中黄鳍鲷的肠道微生物群落的未加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）。

 

图6.黄鳍鲷在不同处理下的肠道微生物群落组成，按相对丰度> 1％的门（A）和相对丰度> 5％的属（B）进行分类。

 

通常，变形杆菌门，蓝细菌门，厚壁菌门和放线菌门是黄鳍鲷鱼肠中的主要门（占90％以上）（图6A），与早期在海水鱼类中的发现一致。在高IHg（40％）和高MeHg（30％）组中，变形杆菌门在对照组中的比例最高（69％，平均值，下同），而显著下降（p <0.05）。在变形杆菌门中，通过使用更深的分类学分类，在高IHg和高MeHg处理下（与对照组相比）γ变形杆菌中观察到了显著降低（p <0.05）。Bridge等人也类似地观察到：由于异种生物代谢和MeHg毒性，暴露于MeHg的鱼（Pimephalespromelas）中的γ-变形杆菌减少。除变形杆菌门外，蓝藻门菌（3.4–40％）和厚壁菌门（17–27％）也对黄鳍鲷的肠道微生物组做出了重要贡献。但是，有研究者发现，在相同鱼类中，蓝细菌（丰度<1％）和厚壁菌门的百分比较低（4.6-15％）。这是合理的，因为肠道菌群更依赖于鱼类的饮食，而且微生物组的组成可能会受到实验装置的影响。食物类型的差异中的红色蠕虫（与我们研究中的商业鱼类饮食相比）可能是检测到群落结构差异的可能原因。高MeHg组（40％）的蓝细菌显著高于对照组（3.4％）（p <0.05），并进一步分为链霉菌属和GpXIII属。蓝细菌可能是来自鱼饮食或海水的鱼肠中的异源群。蓝细菌百分比的升高表明，MeHg抑制了土著菌群的生长，然后可以取代外源微生物。先前的研究还表明，蓝细菌可产生能量或合成维生素B12，这表明蓝细菌的活性可能有助于鱼类抵抗MeHg毒性。但是，该假设尚未得到验证，值得进一步研究。

在这项研究中，我们发现不同处理之间的在属水平上：脱硫弧菌属或假单胞菌属无显著变化（p> 0.05）（图6B）。脱硫弧菌减少硫酸盐的细菌）和假单胞菌分别是潜在的汞甲基化或脱甲基菌。但是，在IHg或MeHg处理中，我们分别观察到甲基化菌或脱甲基化菌的丰度显著增加趋势（p <0.05）（图3）。这可能归因于以下原因：首先，众所周知，甲基化能力取决于细菌菌株而不是物种或属。鉴于减少硫酸盐还原的细菌中只有一小部分能够进行汞甲基化，因此Hg甲基化酶丰度的变化无法反映在属或家庭水平上。其次，mer操纵子已经从最初的地热环境中的简单系统演变为一个复杂的系统，并广泛传播于不同的门（例如，Proteobacteria，Fimicutes，Actinobacteria，Euryarchaeota和Crenarchaeota），这表明汞脱甲基剂不仅限于假单胞菌，还可以分布在其他类群中。假单胞菌可能不是我们研究中Hg脱甲基的重要成员，并且对脱甲基剂的总体丰度贡献很小。鉴于甲基化菌和脱甲基化菌可以分布在各种生物分类中，某些属或种不能代表参与汞生物转化的现实微生物。有研究者建议hgcA和merA基因是用于甲基化或去甲基化的更好，更合适，值得进一步鉴定造成鱼肠中汞生物转化的确切细菌菌株（或物种）的分子探针。另一方面，我们的研究发现在IHg或MeHg处理下，分别增加了Hg甲基化或去甲基化（hgcA或merA基因）的丰度（图3）。这表明肠道微生物组可能对不同的汞暴露情况做出不同的响应，微生物群的变化可能导致鱼肠中不同的汞生物转化过程，从而影响鱼中的汞形态。总体而言，我们的研究结果有助于加深对肠道微生物组与鱼类体内汞积累之间相互作用的了解。

 

评论

总而言之，本研究提供了强有力的证据，表明在饮食摄入汞的情况下，黄鳍鲷的肠道中会发生汞甲基化和脱甲基化的现象。计算出的去甲基化速率高于甲基化速率，这表明去甲基化可以更强烈地影响鱼类中的汞形态。我们的研究还强烈建议，肠道微生物群的特定群体（拥有hgcA基因的甲基化子和拥有merA基因的去甲基化子）在Hg甲基化和去甲基化中起主要作用，并且肠道Hg的生物转化可显著影响鱼类体内总体Hg的积累和分布。此外，汞暴露也改变了细菌群落组成。在IHg或MeHg处理下，分别增加了Hg甲基化菌或去甲基化菌的富集度。然而，这些变化可能与属水平上细菌群落的改变无关，这主要是由于汞的生物转化能力取决于菌株而不是物种或属。涉及肠道汞生物转化的详细细菌菌株值得鉴定。本研究强调了肠道菌群在鱼类体内汞生物转化中的重要性，并建议对肠道微生物组进行适度调节，以将鱼类中的汞污染降至最低。

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