|
编译：小北，编辑：Emma、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 灰色血小板综合症(GPS)是一种罕见的NBEAL2双等位基因突变导致的隐形紊乱，伴随有出血的症状、血小板α颗粒的缺失、脾肿大以及骨髓纤维化。由于该疾病非常罕见，对其临床后遗症的病理机制研究也非常困难。为了了解病理特征的范围，研究者对47例GPS病人进行了详细的临床基因型和表型的研究，结果发现在NBEAL2中有32个新的病因变异。GPS病人群具有常见的表型，包括大血小板减少、BM纤维化、嗜中性白细胞巨核细胞共生、脾肿大以及血清中维生素B12的水平升高。在本研究中研究者也观察到新的临床表型，包括白细胞计数减少、自身免疫疾病增加以及自身抗体阳性。在GPS的血小板、嗜中性粒细胞、单核细胞以及CD4巨噬细胞的转录组和蛋白组具有大范围的不同。在这些细胞中富集较少的蛋白在颗粒成分中富集，说明了Nbeal2在大量血细胞中这些细胞器的功能。GPS血浆的蛋白组学分析发现，与炎症和免疫应答相关的蛋白水平升高，此外1/4升高的血浆蛋白是在造血细胞外合成的，主要在肝脏。总之，研究者发现GPS中除了已知的血小板缺陷，同时也有免疫缺陷。异常的免疫细胞可能是全身异常，如自身免疫疾病的驱动因子。 论文ID 实验设计 对47例GPS病人进行了详细的临床基因型和表型的研究，结果发现在NBEAL2中有32个新的病因变异。 Nbeal2-/-小鼠表现出GPS的特征，包括出血、血小板减少、血小板α颗粒的缺失、脾肿大以及骨髓纤维化。除了已知的巨核细胞血小板轴线的缺失，研究者报道了Nbeal2-/-小鼠更易受到细菌和病毒的感染，这对器官损伤增加、存活率降低以及感染后恢复的时间延长等方面起重要作用，导致自然杀伤细胞以及嗜中性粒细胞中分泌型颗粒缺陷。此外Nbeal2-/-小鼠中的肥大细胞在储存囊泡中不足，并且单核细胞粒度降低。总之研究者发现在Nbeal2-/-巨核细胞(MKs)中存在一个促炎症图谱，说明Nbeal2对MKs、血小板以及许多髓性和淋巴细胞中正常颗粒功能是非常重要的。 考虑到NBEAL2双等位基因突变导致GPS的研究稀少，研究者建立了国际合作以系统评估大量病人的临床和实验室表型，通过聚焦于与免疫相关的特征并且利用蛋白质谱（MS）以及RNA-seq对病人血浆、血小板以及三个不同的白血病群体进行了详细的分子描述。 实验结果 1. NBEAL2广泛的突变体导致了GPS 38个基因上独立的47例病人在11个国家的21个医院参加了该研究。研究者确定了NBEAL2中70个双等位基因突变，其中32个是新发现的（图1A）。43%的突变体是纯合遗传，57%的是杂合子。56个突变体是特异的，64%被划分为PV或者LPV（图1B）。在特异的突变体中，有38例在基因组集簇数据库以及1000000基因组计划的162100个体的基因型结果中缺失，剩余的18例微小的等位基因频率<0.00004。 无义突变占双等位基因突变的49%，剩余的分类为移码突变、获得终止密码子、剪切、插入/缺失。研究者在Nbeal2五个已知结构域上绘制了无义突变的位置，并且确定影响残基的进化保守分值（图1C）。无义突变在高度保守的BEACH结构域上富集(P = 4.91 x 10-5)，与该结构域在Nbeal上的功能是一致的。 图1 GPS病人中确定的NBEAL2突变体 A） 利用参考基因组GRCh37相对于Chr3上NBEAL2的56个特异突变体位置。垂直的黑线代表外显子。颜色和形状代表突变体。B）依据ACMG向导利用致病性分类的特异突变体的频率。C）与Nbeal2的氨基酸序列和已知的功能结构域相比无义突变的位置（x轴）。突变体的y轴位置是利用ConSurf计算的最终进化保守性的分值。正值代表低的保守性，负值代表高的保守性。垂直的灰线代表50%可信度区间保守值的范围：下面和上面的分别代表25th和75th百分数。 研究者随后在另一含有BEACH结构域蛋白（BDCP）Nbea晶体结构上绘制了13个BEACH无义突变。五个突变发生在BEACH的疏水中心，该部分能够与邻近的PH相互作用，PH是一个129个残基的结构域带有一个神经元的保守分值。然而，研究者确定了一个新的无义突变R1979W，在PH上高度保守，这一突变的位置与Nbea R2208对应，并且与PH-BEACH界面功能相关。这是第一个在PH发现的双等位基因突变。 2. GPS中出血和血小板的表型 被招募到研究中的病人年龄在6到70岁之间，平均年龄在35岁。陈述时的平均年龄是11.5岁，但是在2个月到67年之间变化。所有的病人血小板数量异常减少，并且对血小板中ɑ-颗粒减少的评估是通过电子显微镜或光学显微镜实现的（图2A）。与之前的报道一致，大范围的出血症状表现为从皮下注射到颅内出血。而五个病人未发生出血。 3. B12水平升高并且BM纤维化稳定 31/34例病人B12的水平升高。B12在2/3的病人中至少1.5倍的升高。 对23例病人BM活组织检查，13（57%）被诊断出BM纤维化。环钻样本中央五个进行形态学检查发现三系造血的保守性。BM纤维化被诊断的平均年龄是28.5（在10-52范围），中位值为16岁。病人20.3在32岁接受了一个同种异体干细胞移植，但是剩余的病人并未进行相应处理。在三个GPS BM环钻中平均58%的MKs观察到嗜中性粒细胞共生（图2B、2C）。 4. GPS病人免疫系统异常，包括自身免疫疾病影响的多个器官系统 HPO条目的临床和实验信息确定了91%的病人具有与免疫系统异常相关的表型（图2A）。在40%的病人中观察到脾肿大，但是与BM纤维化并不显著重叠。“异常的免疫系统形态”（81%）大部分是由于至少一种白细胞类型（77%）的血球减少。“异常的免疫系统生理学”（51%）包括复发性感染（17%），大多数是常见的呼吸道感染、中耳炎，以及自身免疫（43%），由自身免疫疾病以及阳性的自身抗体构成。12个病人（26%）被诊断为自身免疫疾病，并且大范围的器官系统受到影响，包括激素、骨骼、外皮以及免疫系统（图2D）。对29例病人进行了自身抗体的检测发现17例中至少存在一例阳性。四个最常见的阳性检测包括TPO、PANCA、RF以及ANA。 5. 在GPS病人多样的细胞系中改变的血细胞参数 研究者将47例GPS病人与INTERVAL研究中45,032例健康血液捐赠者比较，发现在男性和女性GPS患者中全部白细胞数量的中位值显著低于INTERVAL中的参与者（图2E）。所有分化白细胞的中位值、血小板的数量以及红血球素的浓度都显著低于对应的INTERVAL值。尽管研究者发现白细胞、颗粒或者单核细胞与BM纤维化之间并不存在关联（P > 0.05），但是血细胞和淋巴细胞数量与后者紧密联系（P < 0.05）。此外，在整体的或者任意分化的白细胞和脾肿大之间没有关联（P > 0.05）。将五个GPS病人与五个对照以一个单独的中心测量CBC进行后续研究，包括额外的参数（FSC和SSC），这一分析证实嗜中性粒细胞、单核细胞以及嗜碱性细胞数量在GPS病人中显著降低（图2F）。FSC和SSC的测量也发现GPS嗜酸性细胞在大小和粒度上都显著降低，嗜酸性粒细胞具有同样的结果（P < 0.05）。 图2 新的临床表型 A) HPO树总结在47例GPS病人中代表三个频率最高的HPO器官系统：血液、免疫系统和代谢。影响8例甚至更多病人的HPO条目与出血相关。HPO相关标签见文中列表。B)病人ID20.3 BM环据CD61染色图像，通过两个MKs表现出与嗜中性粒细胞共生。C)散点图展示了在三个GPS病人和三个对照中与嗜中性粒细胞共生的MKs比例。D)29例GPS病人自身免疫疾病、自身抗体检测以及出血症状的展示。自身抗体检测至少在三个病人中进行。E)直方图展示了在INTERVAL研究中45032个血液捐赠者中整体白细胞的数目。在男性和女性GPS病人中全部白细胞数量的中位数显著低于INTERVAL参与者。F)五个GPS患者vs五个对照全血数量（CBC），数据点代表一种细胞类型，CBC参数表现了绝对标准化效果大小和方向性，y轴显示p值，水平线代表P <0.05。 6. 基因型-表型分析 研究者依据类型、位置以及病因变异的致病性分类，对病人的亚群进行比较，以确定在BDCPs中病因变异导致的表型差异是否和已经报道的其他遗传紊乱一样。 首先，研究者将病人分组为双等位基因功能丧失(LoF)的突变（移码、终止子获得以及剪切）与由氨基酸序列的一个变化导致的双等位基因突变，但是没有截短，排除了一个LOFTER和一个蛋白变化突变体杂合的病人。在LoF组中23例病人，在蛋白改变组中18例病人。研究者发现两个群组间年龄、脾脏大小以及CBC参数没有显著的差异，并且BM纤维化、复发性感染以及自身免疫疾病中没有显著表现（P > 0.05）。 研究者随后进一步进行了两组比较，利用相同的变量和统计检验重复上述分析：双等位基因BEACH无义突变(n = 7) vs 除了BEACH之外的其他无义突变(n = 5)；等位基因VUS(n = 10) vs 等位基因LPVs或者PVs (n = 28)。尽管样本量受限，在基因型-表型的关联中并没有发现显著的联系。 7. 在GPS中血小板和白细胞改变了转录组和蛋白组图谱 基于自身免疫疾病的发生以及CBC参数的改变，研究者致力于获得GPS病人中细胞表型差异的全面理解。通过RNA-seq和蛋白MS对血小板、嗜中性粒细胞、单核细胞以及CD4-淋巴细胞进行分析，并且将获得的结果与对照组对比。基础成分分析发现在四个血细胞样本中差异表达基因的数目从95到255变化，差异丰度的蛋白从63到123变化（图3A）。在GPS病人血小板、嗜中性粒细胞以及单核细胞中123,65以及63个差异丰度的蛋白分别降低89%, 86%, 以及62%。这些降低的蛋白在关于细胞颗粒及其管腔的GO条目中富集，包括Nbeal2在内的9个蛋白在至少三种血细胞的GPS病人中显著降低，并且都定位在血细胞颗粒上（图3B）。 8. GPS血小板在ɑ-颗粒中消失，但是仍然包含嗜中性粒细胞颗粒蛋白 在ɑ-颗粒或者血小板释放时差异丰度更低的蛋白显著过量。RNA-seq分析发现这些蛋白都没有差异表达，提示Nbeal2的功能缺失并不影响血小板中ɑ-颗粒相关基因的转录输出。随后研究者探究了GPS血小板中13个蛋白的差异丰度，发现包括Elane和Mpo在内的5个蛋白都坐落在嗜中性粒细胞的颗粒上（图3C）。此外，当利用更严格的限定值分析血小板的蛋白组学数据，研究者在GPS血小板中确定了54个丰度更高的蛋白。这些蛋白中有14个正常坐落在嗜中性粒细胞颗粒上，提示在GPS血小板上嗜中性粒细胞颗粒蛋白也显著过量。重要的是，这14个蛋白中没有坐落在血小板颗粒，只有5个之前检测到在血小板蛋白组中并且只有3个在GPS血小板转录组中差异表达。 9. GPS嗜中性粒细胞和单核细胞在颗粒蛋白中缺乏 为了探究GPS嗜中性粒细胞蛋白组，研究者对差异丰度的蛋白进行了注释。对于已知的颗粒蛋白，通过颗粒的亚型进一步注释。在GPS嗜中性粒细胞中56个丰度差异的蛋白降低（图3A），36（65%）可能被定义为不同的颗粒亚群（图3D），并且正常坐落在明胶酶和特异颗粒上的蛋白显著过量。考虑到GPS病人中单核细胞的数量降低，研究者猜想Nbeal2的功能缺失可能会影响这些细胞的粒度。由于对单核细胞颗粒蛋白组没有权威的发表，研究者将差异丰度的蛋白与血小板释放液、ɑ-颗粒以及嗜中性粒细胞颗粒进行比对，如果他们重合则注释为颗粒蛋白。在GPS单核细胞中39个蛋白降低，29个蛋白是颗粒邻近的。与GPS血小板和嗜中性粒细胞相似，编码这29个蛋白的基因在研究者的RNA-seq中并未差异表达。 10. GPS CD4淋巴细胞上调免疫应答的标记物 考虑到CD4淋巴细胞和自身免疫疾病之间的关系，研究者也将这些细胞进行RNA-seq和蛋白MS评估。与其他三种细胞类型的分析相反，在GPS CD4淋巴细胞中大多数差异丰度的蛋白57/71升高（图3A），并且与基因表达相关。在这些差异蛋白/基因中丰度更高表达量更高，对参与免疫调节功能的蛋白过度表达，包括BtK和Fcer1a。 图3 血小板、嗜中性粒细胞、单核细胞以及CD4-淋巴细胞的转录组和蛋白组学 在所有组中log2倍数代表RNA-seq的基因表达和MS的蛋白丰度，由五个GPS患者和五个对照中log2个体标准化值的平均转换率确定。负值代表在GPS中代表的基因/蛋白降低。差异丰度/表达是由每个实验方法和对应的分析确定的。A)条形图代表RNA-seq（左）的差异表达基因以及MS（右）差异丰度的蛋白。Y轴代表每种方法确定的基因或者蛋白数量并且负值代表GPS细胞中显著降低。每种细胞类型差异丰度更小的蛋白中最显著的GO细胞内组分条目在蛋白组中说明。B)对于每个个体，蛋白丰度由至少在三种类型细胞中差异丰度更小的每个蛋白进行计算并且在所有细胞类型中取平均值。结果从-1到1的范围，并且用热图绘制，阳性（蓝色）阴性（黄色）分别代表更高或者更低的蛋白丰度。每个条形柱代表一个GPS个体或者对照。C)血小板基因表达和蛋白丰度比较说明ɑ-颗粒和释放液蛋白的比例很高，在GPS蛋白水平显著降低，并且发现在GPS血小板中坐落在嗜中性粒细胞颗粒上的蛋白升高。D)通过亚细胞定位垂直分离的嗜中性粒细胞（GPS vs 对照）中基因表达和蛋白丰度的比较发现，在GPS嗜中性粒细胞中特异的明胶酶颗粒蛋白丰度显著更低。 11. GPS血浆蛋白组具有促炎症和肝脏的特征 研究者假定血细胞中颗粒的异常升高可能导致血液循环中系统的改变。为了进行验证，研究者利用SWATH-MS分析了11个病人以及13个对照中的血浆。首先对病人和对照样本中分离得到的正常浓度的血浆蛋白进行无差别的随机森林分析，并且确定了51个差异的蛋白（图4A）。分析结果发现在病人中分别有11和40个差异蛋白具有较高或者较低的浓度。GO富集分析说明与炎症和免疫应答相关的条目存在，特别是在GPS血浆中11个丰度更高的蛋白中排序高的GO条目（图4B）。研究者随后将差异的血浆蛋白和分析过的四个细胞类型的蛋白组进行重合。有14个差异的血浆蛋白在至少一种细胞类型中的蛋白组学丰度不同，但是蛋白质图谱不同（图4C）。有趣的是，在GPS血小板蛋白组中蛋白的丰度更少。相反，四个重合的蛋白在血浆中的水平高于在嗜中性粒细胞颗粒上。其中，Camp、Crisp3以及Lcn2在GPS嗜中性粒细胞差异丰度更小，并且所有的都定位在嗜中性粒细胞特异的颗粒上。 将差异的血浆蛋白与BLUEPRINT共同体基因表达数据交叉比对，发现14个血浆蛋白不在造血细胞上表达（图4B）。随后研究者在基因型-组织表达(GTEx)数据库中分析了这14个蛋白的基因表达，说明这些非造血的蛋白中有9个主要是有肝脏上的细胞合成的，包括已知的急性相反应物例如Crp和Lbp（图4D），在GPS病人的血浆中两者的水平都升高。 图4 GPS血浆蛋白组 A)在11例GPS病人和13例对照中检测到的51个差异蛋白标准蛋白丰度的热图，通过无差别的聚类分离。每个柱形图代表一个GPS患者或者对照。B)通过GPS血浆方向、细胞起源和亚细胞定位对血浆蛋白组中51例差异蛋白分类。参与炎症或者免疫反应的蛋白被标注为黄色。C)散点图代表通过SWATH-MS 评估的14个差异血清蛋白在至少一种细胞类型中的丰度差异。每个数据点代表一种蛋白并且在各自蛋白组中用颜色标记。D)热图显示在基因型-组织表达项目中非造血起源的14个差异血浆蛋白的基因表达。 结论 研究者确定了GPS新的特征，包括白细胞数量减少、自身免疫素质、髓性细胞粒度不足以及一个促炎症的血浆蛋白组。通过在临床和细胞水平对GPS病人的表型进行分析，研究者为Nbeal2在颗粒、血小板细胞生物学以及免疫细胞中的功能进一步提供了证据，并且说明了这种普遍的免疫异常与稀有出血紊乱之间的相关性。 |
|
|
