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编译：彭翰林，编辑：Tracy、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 在单纯疱疹病毒1(HSV-1)感染的过程中，定量蛋白质组分析被用于探究宿主细胞蛋白质组和病毒蛋白组的变化。HSV-1以几种宿主细胞蛋白为目标进行快速降解，比如细胞运输因子高血糖相关的PDZ和含有卷曲螺旋基序的蛋白GOPC。我们发现HSV-1pUL56直接与GOPC结合，刺激GOPC泛素化和蛋白酶体降解。质膜分析显示，pUL56介导了感染细胞表面蛋白组的特异性改变，比如白细胞介素18(IL18)受体和toll样受体2(TLR2)的丢失。该研究为未来研究HSV-1与宿主相互作用提供了研究基础。 论文ID 实验设计 实验结果 1. HSV-1感染的QTV研究 为了构建在HSV-1感染过程中宿主和病毒蛋白变化的全局图，用HSV-1多次感染人角质细胞系(HaCaT)(图1)，免疫荧光分析证实>95%的细胞被感染。我们使用Ten-plexTMTs和MS3来量化6个时间点上蛋白表达的变化(图1A)，从而产生了迄今为止HSV-1复制周期中最完整的蛋白质组数据集，量化了6956个人类蛋白和67个典型HSV-1蛋白，并提供了在感染期间蛋白表达变化的全局视图。我们对整个感染过程中的病毒蛋白表达进行时间分析，深入了解病毒与宿主蛋白的相互作用。 HSV-1感染导致496个人蛋白下调，34个蛋白上调。细胞蛋白质组最广泛的变化发生在感染后期，这可能是由于病毒能够强烈地影响宿主活性(图1B)。目前已有多个已知在HSV-1感染期间特定下调的宿主靶标被证实，比如DNAPKcs(PRKDC)，干扰素gamma-inducible蛋白质16(IFI16)和E3泛素蛋白连接酶等(图1C-1D)。这些数据证实了在病毒感染期间蛋白和总RNA丰度的普遍下降(图2A)，然而它也同时表明，丰度下降最大的蛋白是HSV-1特异性针对降解的蛋白，而不是抑制转录或翻译(图2A)。 2. HSV-1感染后的生物信息学富集分析 使用DAVID软件分析下调蛋白中显著富集的途径(图2B)。结果显示，泛素样(Ubl)偶联途径显著富集，与已知疱疹病毒靶向某些途径导致细胞降解的情况一致，而对上调显著的宿主蛋白进行类似分析没有发现任何富集的途径。 图2 HSV-1感染过程中宿主细胞通路的调控 (A) 散点图比较蛋白质丰度与总RNA、新合成RNA和核糖体蛋白；(B) 在感染期间的任何时间对所有人类蛋白下调2倍以上的蛋白进行DAVID富集分析；(C) 泛素样(Ubl)偶联途径下调蛋白的时间谱示例；(D) 2hpi定量的所有蛋白散点图；(E) HSV -1感染的所有蛋白在2 hpi时下调大于4倍的时间分布 3. 在HSV-1感染后，识别宿主的靶点迅速消失 之前已有研究表明，病毒感染早期表达下调的宿主蛋白中可能富含抗病毒活性因子，因此研究人员分析了在HSV-1感染后最早时间点下调>4倍的蛋白(图2D和2E)中的其中6种，其中有4个（methyl-CpG-binding域蛋白1 (MBD1)、MORC3、TRIM27和锌指蛋白462（ZNF462））被证明在感染HSV-1的细胞中表达显著减少。另外2种蛋白(senataxin 和GOPC)此前尚未被确定为HSV -1介导的降解靶点。 4. pUL56结合NEDD4家族的泛素连接酶和GOPC ITCH是泛素连接酶NEDD4家族的一员，在HSV-1感染期间迅速消失(图1B-1E)。来自HSV-1和HSV-2的pUL56蛋白与ITCH和NEDD4相互作用，导致这些靶点被蛋白酶体降解。pUL56是在纯化病毒粒子中发现的尾部锚定II型膜蛋白，包含三个PPXY基序，可能通过与NEDD4中的WW结构域结合从而发生相互作用。pUL56不包含任何赖氨酸残基，因此是很难被泛素化降解的。为了进一步表征pUL56的结合过程，我们对表达GFP标记的pUL56或GFP的细胞进行了氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)免疫沉淀-质谱(IP-MS)分析(图3A)，发现泛素连接酶NEDD4家族的几个成员在和多转运蛋白颗粒复合物II (TRAPPCII)亚基被富集，并且GOPC还被确定为pUL56的结合分子。共沉淀分析表明，被纯化谷胱甘肽s -转移酶(GST)标记的pUL56胞质结构域能够结合纯化的GOPC，证实这两种蛋白的直接相互作用(图3B)，GOPC的结构显示27-236残基和N端卷曲区域足以与pUL56结合(图3D)。综上所述，这些结果探明了pUL56结合GOPC和NEDD4家族泛素连接酶的模型。 图5 pUL56结合GOPC和细胞泛素连接酶 (A) 用GFP标记的pUL56或GFP单独转染标记的HEK293T细胞进行免疫沉淀(IP)；(B) 使用纯化重组成分进行下拉实验，证明GST标记的pUL56与GOPC的卷曲区域直接相互作用；(C) 带GFP标记的pUL56 IP实验结果；(D) pUL56和GOPC连接的示意图。 5. pUL56通过蛋白酶体介导GOPC的降解 为了确定GOPC降解的机制，研究人员用野生型(WT) HSV-1或缺乏pUL56表达的HSV-1（ΔUL56）质粒感染细胞。免疫荧光结果显示，在HSV-1感染的细胞中，MG132（蛋白水解抑制剂）抑制了pUL56依赖的GOPC水解(图4B)。为了进一步验证NEDD4家族E3泛素连接酶对pUL56降解GOPC的重要性，研究人员构建了一种新的重组病毒，将所有三个pUL56 PPXY基序突变为AAXA。研究表明，GOPC的降解依赖于pUL56的PPXY基序，因为在表达GFP-pUL56-AAXA的细胞中，GOPC并未被完全降解(图4C)。在WT pUL56存在的情况下，GOPC与NEDD4-WW共沉淀形成一个三联复合体，说明其中GOPC与NEDD4的结合是由pUL56介导的(图4E)。总的来说，这些数据表明，pUL56招募NEDD4家族泛素连接酶来介导GOPC的泛素化和蛋白酶体降解。 图4 pUL56对于GOPC的降解是必要的 (A) HaCaT细胞的在MOI 10期感染病毒。2小时后，用MG132或DMSO载体替换培养基，继续感染。在16hpi收集细胞裂解液，用免疫印迹法检测蛋白；(B) 在MOI 1期感染HFF hTERT细胞，然后按照(A)中所述，用MG132或载体处理HFF hTERT细胞。在6 hpi时，固定标本并染色；(C) 用GFP-pUL56或GFP-pUL56- AAXA表达质粒转染U2-OS细胞；(D) 用病毒在MOI 10期感染HaCaT细胞，收集16 hpi细胞裂解液，用免疫印迹法检测指示蛋白；(E) 用YFP标记的NEDD4-WW结构域、myc标记的GOPC和未标记的pUL56或pUL56- AAXA表达质粒转染HEK293T细胞。对样品进行IP检测；(F) 将HA标记的泛素(HA-Ub)和myc-GOPC表达质粒一起转染HEK293T细胞 6. HSV-1在细胞培养期间的复制不依赖于pUL56 在HSV-1感染期间，细胞中GOPC的快速减少意味着去除这种宿主蛋白对病毒的有效复制很重要。然而，HSV-1 ΔUL56的生长动力学与HSV-1 WT的生长动力学基本相同(图5A)，在感染期间，内源性的GOPC水平保持不变。这些数据表明，在细胞培养中，pUL56对于HSV-1的复制是可调节的。pUL56可能参与调节了对HSV-1的抗病毒免疫反应，就像许多疱疹病毒蛋白一样，这些蛋白在细胞培养中是可有可无的，但在体内复制很重要。 图5 pUL56降解目标的识别 (A) 用HSV-1 WT和HSV-1ΔUL56感染HaCaT细胞，MOI 10期，在指定时间点用空斑试验测定感染病毒总数；(B) 重复生物标本中HSV-1 WT和HSV-1 ΔUL56在HaCaT、HFF、和Vero细胞中的空斑分析；(C) 测量(B)的菌斑直径，并归一化至HSV-1 WT的平均值；(D) 蛋白质组工作流程示意图；(E) 所有蛋白质定量散点图；(F) 与mock相比，HSV-1 WT表达下调>2倍的蛋白以及HSV-1 ΔUL56 >表达上调2倍的蛋白。 7. 鉴定被pUL56特异性耗尽的宿主蛋白 为了鉴定被pUL56消耗的细胞蛋白，我们用HSV-1 WT或ΔUL56感染HaCaT细胞，然后采用基于TMT的蛋白质组学分析(图7D)。我们发现在被量化的7696个人类蛋白中，只有少数蛋白在ΔUL56感染之后表现出显著的丰度变化，观察到的最大变化是GOPC(图7E和7F)。 8. pUL56活性改变了质膜蛋白质组 调节细胞表面的蛋白质是多种病毒使用的一种免疫逃避策略，因此我们利用质膜实验分析了细胞感染HSV-1 WT或ΔUL56复制的早期阶段宿主蛋白的表达(图6)。数据的分级聚类鉴定出了HSV-1 WT感染细胞的质膜上丰度较低的宿主蛋白，而这些蛋白表达被pUL56缺失所拯救(图6B)。这些蛋白包括免疫信号蛋白TLR2、白介素-18r1(IL18R1)、DUOX1(双氧化酶1)和溶质载体(SLC)家族的一些成员(图6B和6C)。WT pUL56的表达降低了细胞表面TLR2表达，但不影响细胞内的表达水平(图6D)，表明pUL56调节TLR2亚细胞定位，而不是针对其降解。 图6 pUL56通过控制宿主转运到质膜来调节免疫受体 (A) 实验工作流程示意图；(B) 对两两比较的折叠式变化值进行层次聚类分析；(C) 示例蛋白的谱图显示HSV-1 WT下调>2倍和HSV-1 ΔUL56挽救>2倍；(D) 用FLAG-TLR2和pUL56或pUL56- AAXA表达质粒转染U2-OS细胞。 9. TLR2细胞表面表达依赖于GOPC 为了探究细胞表面TLR2的丢失是否由于GOPC介导的转运中断，研究人员使用CRISPR/Cas9基因编辑生成了GOPC敲除的HaCaT细胞。并且还使用了基于TMT的质膜分析方法，针对GOPC生成了三个独立单细胞敲除克隆进行质膜分析(图7A和7B)。在3个独立的GOPC敲除克隆中，有4个蛋白平均下调>2倍，其中TLR2的下调最为显著 (图7C和7D)，流式细胞术进一步证实了缺乏GOPC的细胞中TLR2的缺失。正常HaCaT细胞包括TLR2+群体，而所有三个GOPC敲除克隆的细胞表面TLR2都降低了(图7E)。综上所述，这些数据表明，TLR2在角质细胞表面的表达依赖于GOPC。 图7 GOPC对于TLR2在质膜上的表达很重要 (A)免疫印迹分析GOPC敲除细胞；(B)实验工作流程示意图；(C)比较3个GOPC敲除细胞系和WT HaCaT细胞的表达平均值；(D)每个独立细胞系中被下调>2倍的蛋白质的图谱；(E)流式细胞术分析HaCaT WT细胞和3个GOPC敲除克隆的质膜TLR2水平。 讨论 在这项研究中，我们结合了三个强大的蛋白质组学技术：QTV(图1、2和5)，免疫亲和实验(图3)和质膜蛋白质组学(图6和图7)，发现HSV-1 pUL56促进了宿主细胞GOPC蛋白降解，从而降低了大量的重要免疫信号分子（如TLR2）在感染细胞质膜的表达。生化实验和细胞生物学实验(图3，图4、5、7)证实，pUL56 与GOPC结合，同时还需要NEDD4家族的泛素连接酶来刺激GOPC泛素化降解，从而导致细胞表面蛋白质组的变化。 1.对HSV-1感染的一些见解 本文提供的多重定量蛋白质组学数据是迄今为止HSV-1感染后宿主细胞蛋白质组变化最全面的分析，包括了来自全细胞样品的约7,000种宿主蛋白和在三个独立的数据集中定量的约700种质膜蛋白。将全细胞蛋白质组学数据与已发表的转录组数据以及质膜蛋白质组学实验结果进行比较，我们可以得出有趣的结果：全细胞样品中HSV-1介导的蛋白质下调主要与降解相关，而质膜中蛋白质的下调却主要与细胞内螯合相关。这些观察将需要在未来的研究中进一步证实，例如通过使用蛋白质降解抑制剂或免疫荧光显微镜分析HSV-1感染的蛋白质定位情况。 本文的QTV数据还为HSV-1蛋白产生动力学的研究提供了重要视角。K-means分析确定了五个不同的蛋白质表达谱。我们在同一类别（Tp2）中发现了早期基因，这大概是由于我们以2 hpi作为最早的时间点。但这可能掩盖了早期基因类别动力学曲线中的某些差异，而且晚期基因似乎聚集在三个不同的组中。 HSV-1蛋白丰度的动力学分析还确定了ICP47（US12）具有单独的时间分布。所有其他病毒蛋白在整个感染过程中其丰度都会增加，而ICP47的数量在感染过程中会提前达到峰值，随后被下调。ICP47结合并抑制带有抗原肽（TAP）的MHC-1复合物，从而预防肽出现在细胞表面并促进免疫逃逸。ICP47在感染过程中的表达变化可以通过精确调节细胞表面的MHC-1水平，从而实现维持CD8+ T细胞逃逸与抑制自然杀伤细胞（NK）激活之间的平衡。 2. HSV-1pUL56通过募集细胞E3 连接酶降解GOPC 缺乏pUL56的HSV-1病毒在动物模型中的毒性减弱，尽管该蛋白对于在培养细胞中进行病毒复制是必需的（图7A-7C）。我们的数据提供了一种分子机制，即通过促进GOPC的降解以及下调感染细胞表面免疫信号分子表达，pUL56可以增强感染过程中的毒力。 先前来自HSV-1和HSV-2的研究表明pUL56与ITCH和NEDD4相互作用，导致GOPC的降解，但这种作用机制仍然不清楚。我们的IP-MS数据显示pUL56可以结合多个细胞的NEDD4家族泛素连接酶和运输因子GOPC（图3A），还直接结合到GOPC的卷曲螺旋区域（图3B）。此外，结果显示pUL56结合NEDD4的PPXY基序是GOPC降解所必需的（图4C和4D），pUL56可以同时结合GOPC和NEDD4（图4E），并且pUL56也可以刺激GOPC的泛素化（图4F）。总之，这些数据表明pUL56充当将GOPC和NEDD4家族泛素连接酶聚集在一起的支架，以促进GOPC泛素化和蛋白酶体降解。 GOPC在HSV-1 WT感染期间迅速降解（图2D），在HSV-1 ΔUL56感染期间GOPC的丰度得以恢复（图4A，4B，5E和5F）。比较HSV-1 WT与ΔUL56的感染结果，其他几种蛋白质的表达也得到挽救。这可能反映了降解可能是由pUL56直接介导导致，也可能是GOPC丧失引起的间接后果。 3.HSV-1降解转运因子以修饰感染细胞的表面 许多病毒会改变被感染细胞的表面以调节宿主反应。例如，HIV-1 Vpu募集E3泛素连接酶以促进几种细胞表面蛋白的泛素化和降解。除此之外，已有研究显示多种HCMV蛋白通过不同的机制以限制MHC-1和NK细胞受体的细胞表面呈递。我们现在已经确定，至少部分HSV1 pUL56通过特异性降解细胞运输因子GOPC来修饰包括免疫信号蛋白TLR2和IL18受体在内的几种宿主蛋白的表面丰度。此外，我们已经证明了在未感染的人类角质细胞中，TLR2的细胞表面表达依赖于GOPC。 TLR2在天然HSV感染中的作用尚不清楚，有证据表明TLR2对控制感染很重要，而且TLR2的激活会增加小鼠HSV感染模型的免疫反应。除了本文中证实的在感染细胞中pUL56调节细胞表面TLR2水平外，其他研究也证明了其他HSV-1蛋白可抑制TLR2活性，包括ICP0和pUS3，pUL56和其他病毒蛋白对TLR2的调节如何影响HSV感染的发病机制有待进一步研究。GOPC可能是病毒调节的常见靶标，因为有研究显示人类16型乳头瘤病毒E6蛋白结合GOPC并通过宿主E3泛素连接酶E6AP介导其降解。此外，经典的猪瘟病毒NS2蛋白在酵母双杂交筛选中结合了GOPC，尽管尚未确定GOPC在感染该病毒期间是否被降解。 来自马疱疹病毒1型（EHV-1）和4型（EHV-4）的pUL56与HSV-1 pUL56仅具有20％的同一性，但两者均为具有多个PPXY基序且几乎没有或没有胞质的II型跨膜蛋白赖氨酸残基。目前已有研究显示EHV-1和EHV-4均以pUL56依赖性方式下调了感染细胞表面的MHC-1。同样，来自人类疱疹病毒6A（HHV-6A）的U24是含有PPXY基序的尾部锚定（II型）膜蛋白，并已被证明可下调T细胞受体表达。此外，还有研究显示HCMV UL42结合并刺激泛素介导的ITCH降解。因此，含PPXY基序的病毒编码的II型跨膜蛋白募集NEDD4家族泛素连接酶可能是感染HSV宿主细胞中调控细胞膜运输途径的保守机制。 总之，我们的数据为理解HSV与宿主细胞的相互作用提供了广泛的资源。重要的是，我们确定了pUL56靶向GOPC进行蛋白酶体降解，从而从质膜上去除了免疫信号分子。这代表了一种有效机制，通过该机制，HSV-1可以重塑被感染细胞的表面。其他病毒对GOPC的降解可能代表了一种调节感染细胞的细胞表面以逃避宿主免疫监视的通用机制。 |
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